Per iniziare, ottenere l'isolectina B4 o IB4 e sezioni di tessuto polmonare di topo colorate con DAPI. Acquisisci immagini con un microscopio a fluorescenza con un obiettivo 10x. Importare le immagini nel software ImageJ e selezionarle.
Dividi i canali di conseguenza e carica il file in formato ND2 per i canali DAPI e IB4. Passare ad Analizza, Imposta scala. Configurare i parametri dell'immagine, quindi selezionare Globale, quindi OK.To impostare lo stesso intervallo di visualizzazione, andare su Immagine, regolare il contrasto della luminosità e fare clic su Imposta.
Impostare l'intervallo di visualizzazione per IB4 da zero a 10.000 e quello per DAPI da zero a 20.000. Per eliminare lo sfondo, fai clic su Elabora, seguito da matematica. Sottrai il segnale di fondo in base ai valori rilevati dallo strumento bacchetta magica sullo sfondo.
Per selezionare il valore di soglia migliore, vai su Immagine e fai clic su Duplica. Seleziona sia il tipo di immagine originale che quello duplicato su 8 bit. Successivamente, nella scheda Immagine, seleziona Regola seguito da Soglia e Accedi alle modalità.
Dopo aver scelto la soglia più realistica, seleziona Sfondo scuro e applica. Utilizzando lo strumento bacchetta magica, seleziona i vasi sanguigni più grandi rispetto all'immagine duplicata, quindi fai clic su Elimina per eliminare i segnali positivi IB4 da arterie e vene di grandi dimensioni. Per contare il numero di segnali target, fare clic su Analizza, quindi su Imposta misure, quindi selezionare Area, Limita alla soglia e Visualizza etichetta.
Quindi seleziona Analizza particelle e modifica Dimensione da zero a infinito, Circolarità da zero a uno e Mostra come maschere di sovrapposizione. Selezionare Riepiloga e fare clic su OK. Infine, scegli Riepilogo. Fare clic su File e salvare i risultati.
La percentuale di focolai IB4-positivi nei lobi cranici, medi, caudali, accessori e polmonari sinistri può essere distinta tra i topi giovani e quelli di mezza età utilizzando l'analisi ImageJ.
