Dopo la calibrazione del sistema di respirometria, sostituire il MiR05 da ciascuna camera con 2,1 millilitri di soluzione di MiR05 freschi. Nel software per la respirazione, inserire le impostazioni dello strumento. Imposta il nome del file e salva le impostazioni.
Nella finestra di dialogo successiva, immettere le informazioni sul campione, incluso il peso di ciascun campione aggiunto a ciascuna camera. Ora, apri la finestra di calibrazione dell'ossigeno, fai clic su copia da file e seleziona il file di calibrazione dell'aria salvato. Quindi, fare clic sul pulsante Calibra e copia negli appunti.
Utilizzando una pinza fine, trasferire con cura i fasci di fibre muscolari, precedentemente isolati dal topo, nella soluzione respiratoria. Posizionare i tappi sulla camera e spingerli a circa metà del fondo per semichiudere la camera. Una volta che gli O-ring sui tappi si innestano con la parete della camera, utilizzare un movimento rotatorio mentre si spinge verso il basso per chiudere.
Quando la camera è chiusa a metà, si osserva una piccola bolla d'aria nella parte superiore della camera. Riempi una siringa di plastica da 10 millilitri con ossigeno puro da una bombola di ossigeno. Posizionare l'ago lungo e smussato sulla siringa, quindi inserire l'ago nella prima camera ed erogare lentamente circa un millilitro di ossigeno.
Monitorare la concentrazione di ossigeno della camera. Quando la concentrazione raggiunge i 350-400 nanomoli per millilitro, ruotare delicatamente il tappo mentre si spinge verso il basso per chiudere completamente la camera. Osservare la camera e assicurarsi che non rimangano bolle d'aria.
Per normalizzare i dati del flusso di ossigeno alla massa del tessuto dal menu di layout, selezionare il layout 06 flusso specifico per unità di campione. Assicurarsi che la concentrazione e il flusso di ossigeno si siano stabilizzati dopo l'aggiunta di ossigeno per iniziare la misurazione della respirazione. Utilizzando una siringa di vetro da 10 microlitri, aggiungere 2,5 microlitri di malato molare 0,8 in ciascuna camera.
Premere F4 per contrassegnare la sequenza temporale ed etichettare il segno con M.Record flusso di ossigeno stabile per uno o due minuti. Per il glicolitico aerobico, aggiungere 10 microlitri di glutammato a due molari e cinque microlitri di piruvato a due molari in ciascuna camera. Premere F4 per contrassegnare la sequenza temporale ed etichettare il contrassegno con GP. Registrare un flusso di ossigeno stabile per uno o due minuti.
Aggiungere 10 microlitri di glutammato 2 molare e 10 microlitri di palmitoiletlcarnitina 10 millimolari in ciascuna camera per substrati di acidi grassi. Premere F4 per contrassegnare la sequenza temporale ed etichettare il contrassegno con GPC. Registrare un flusso di ossigeno stabile per uno o due minuti.
Utilizzando una siringa di vetro da 25 microlitri, aggiungere 20 microlitri di ADP molare da 0,5 molari in ciascuna camera. Premere F4 per contrassegnare la sequenza temporale ed etichettare il contrassegno con ADP. Registrare un flusso di ossigeno stabile per uno o due minuti.
Ora, aggiungi 20 microlitri di un molare succinato in ogni camera. Premere F4 per contrassegnare la sequenza temporale ed etichettare il segno con S.Record flusso di ossigeno stabile per uno o due minuti. Utilizzando una siringa di vetro da 10 microlitri, aggiungere cinque microlitri di citocromo c da quattro millimolari in ciascuna camera.
Premere F4 per contrassegnare la sequenza temporale ed etichettare il segno con citocromo c. Registrare un flusso di ossigeno stabile per uno o due minuti. Titolare in 3 boli da un microlitro di un millimolare FCCP, utilizzando una siringa di vetro da 10 microlitri.
L'edizione FCCP determina una breve diminuzione dei livelli di flusso di ossigeno. Attendere che il flusso di ossigeno aumenti e si stabilizzi prima di registrare. Premere F4 per contrassegnare la sequenza temporale ed etichettare con FCCP.
Registrare un flusso di ossigeno stabile per uno o due minuti. Una volta completato il test, ruotare delicatamente e tirare il tappo verso l'alto per rimuoverlo. Sciacquare la camera tre volte con acqua ultrapura, seguita tre volte con etanolo al 70%.
Posizionare i tappi nelle camere fino a quando non si avverte resistenza, ma non chiuderli completamente. Quindi, tappare i tappi. Salvare il file del test e scollegare lo strumento dal software.
Infine, spegni il respirometro. In campioni murini adeguatamente preparati, l'aggiunta di citocromo c post-ADP non ha influenzato il flusso di ossigeno, confermando l'integrità della membrana mitocondriale esterna. Tuttavia, quando i campioni di tessuto non sono stati preparati correttamente, l'aggiunta di citocromo c post-ADP ha portato a un aumento del 40% del flusso di ossigeno, indicando un danno alla membrana mitocondriale esterna.
