Per infettare le colture di salmonella con batteri fagici, diluire una coltura notturna di salmonella enterica in un volume finale di cinque millilitri di LB e aggiungere 0,1 millilitri di lisato di fagi batterici precedentemente preparato. Quindi incubare a 37 gradi Celsius e 200 giri/min per 24 ore. In una provetta da centrifuga conica da 50 millilitri, diluire la coltura batterica contenente fagi 100 volte in cinque millilitri di LB filtrato da 0,22 micron. Centrifugare la sospensione per 10 minuti alla dose di 2,377g.
Decantare accuratamente il surnatante, lasciando un po' di volume sul fondo per garantire la presenza di cellule. Lavare le cellule batteriche con 10 millilitri di terreno LB filtrato da 0,22 micron. Dopo aver ripetuto la centrifugazione e il lavaggio per tre volte, risospendere il pellet in cinque millilitri del LB filtrato. Utilizzare un sistema di filtrazione sottovuoto per filtrare 50 microlitri della sospensione batterica ottenuta attraverso un filtro sterile da 0,45 micron.
Sciacquare il filtro con 100 millilitri di LB.To filtrato facilitare il rilascio dei fagi dalle cellule batteriche, incubare il filtro contenente le cellule senza smontare il sistema. Sciacquare nuovamente il filtro, come dimostrato in precedenza, utilizzando il sistema di filtrazione sottovuoto. Per recuperare le cellule batteriche dal filtro utilizzando una pinza sterile, trasferire il filtro in un pallone.
Quindi aggiungere due millilitri di 2x LB sul filtro e pipettare più volte per rilasciare le cellule dal filtro. Centrifugare un millilitro di questa sospensione per due minuti a 10,354 g. Dopo aver scartato il surnatante, lavare le cellule tre volte con un millilitro di terreno LB filtrato.
Quindi risospendere le cellule in un millilitro di 2x LB. Successivamente, mescolare il lipopolisaccaride commerciale di salmonella enterica, o LPS, con 20 microlitri di sospensione batterica in un millilitro di LB filtrato. Incubare la miscela per due ore a 37 gradi Celsius agitando a 200 giri/min per prevenire la reinfezione dei fagi batterici. Successivamente, trasferire un millilitro di coltura in una provetta da microcentrifuga e centrifugare la sospensione per due minuti a 10,354 g. Lavare il pellet tre volte con un millilitro di terreno LB filtrato.
Dopo il lavaggio, risospendere il pellet in un millilitro di 2x LB. Aggiungi 20 microlitri di questa miscela a un millilitro di LB filtrato, contenente 0,8 milligrammi per millilitro di LPS commerciale. E incubare la miscela a 37 gradi Celsius e 200 giri/min per due ore. Successivamente, pellettare un millilitro di coltura in una provetta da microcentrifuga mediante centrifugazione per due minuti a 10, 354 g.
Dopo aver lavato tre volte le cellule con LB filtrato, risospenderle in un millilitro di LB filtrato. Utilizzando un sistema di filtrazione sottovuoto, passare un millilitro di sospensione batterica attraverso un filtro sterile da 0,45 micron e sciacquare il filtro utilizzando 100 millilitri di LB filtrato. Trasferire il filtro in un pallone utilizzando una pinza sterile. Aggiungere due millilitri di 2x LB sul filtro e pipettare più volte per rilasciare le cellule dal filtro. Centrifugare un millilitro di cellule per due minuti a 10,354 g prima di lavare tre volte con LB filtrato. Risospendere le cellule raccolte in un millilitro di 2x LB.To preparare l'inoculo fago-free, aggiungere 100 microlitri di cellule dalla sospensione batterica a 900 microlitri di LB contenenti 0,45 milligrammi per millilitro di LPS.
Incubare a 37 gradi Celsius per 24 ore agitando a 200 giri/min. Usalo come aliquota per confermare l'assenza di reinfezione dei fagi. Eseguendo titolazioni in diverse fasi del protocollo, è stato osservato che il lavaggio e il filtraggio ripetuti non erano sufficienti per eliminare i fagi batterici dalle colture.
Tuttavia, il numero di fagi è diminuito non appena è stata impiegata una fase di incubazione con LPS commerciale. Il passaggio cruciale per la completa rimozione dei fagi batterici nella coltura batterica è stata la seconda incubazione con LPS commerciale.
