Per iniziare, piastra 3 volte 10 alla potenza delle cellule di fibrosarcoma 6MCA205 in 10 millilitri di terreno di crescita completo in una capsula di Petri da 100 millimetri. Irradiare le cellule con luce ultravioletta e incubare a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per almeno sei ore per farle morire. Lavare in vitro le cellule dendritiche differenziate, o DC, due volte, a 1100G per quattro minuti in un terreno di crescita completo.
Contare le DC vuote derivate dal midollo osseo utilizzando il test di esclusione del colorante blu di tripano. Centrifugare le cellule tumorali irradiate a 1100G per cinque minuti. Impostare la co-coltura di DC vuote con cellule apoptotiche irradiate a un rapporto di due a uno in una piastra a 12 pozzetti per 24 ore a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica.
Il giorno successivo, lavare le cellule due volte a 1100 G per cinque minuti in 10 millilitri di terreno di crescita completo in provette da 15 millilitri. Per la colorazione della superficie cellulare, risospendere le DC derivate dal midollo osseo in 20 microlitri di tampone FACS freddo e incubare per 20 minuti a quattro gradi Celsius al buio. Dopo aver lavato le cellule con tampone FACS, aggiungere 100 microlitri di PBS contenente colorante fissabile nel vicino infrarosso per 30 minuti.
Lavare le celle una volta con PBS prima di rimetterle in sospensione nel tampone FACS. Identifica le celle di interesse in base alle loro proprietà FSCA e SSCA. Quindi tracciare FSCA e FSCH per escludere dall'analisi i doppietti e i grumi cellulari.
Tracciare un'area del filtro passa-banda di emissione da 780 a 60 nanometri e SSCA per rimuovere le cellule morte. Utilizzando filtri passa-banda di emissione da 575 a 26 e da 530 a 30 nanometri, è possibile rilevare la positività cellulare per il marcatore CD11C e il linker cellulare fluorescente PKH67 in due grafici di densità dei parametri. Dopo il conteggio, coltivare le cellule T CD8 con DC derivate dal midollo osseo che avevano assorbito cellule MCA205 apoptotiche con un rapporto da due a cinque a uno a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 72 ore.
Aggiungere EdU al terreno di co-coltura alla concentrazione finale di 10 micromolari e incubare per 16-20 ore. Centrifugare due volte il primer incrociato CD8 a 1100G per cinque minuti e colorare i marcatori di superficie in tampone FACS freddo per 20 minuti a quattro gradi Celsius al buio. Dopo aver lavato due volte le cellule in tampone FACS, risospenderle in 100 microlitri di PBS contenente il colorante aqua fissabile vitality per 30 minuti.
Lavare una volta le sospensioni cellulari con tre millilitri di 1% BSA in PBS in provette di flusso. Aggiungere 100 microlitri di paraformaldeide al 4% per 15 minuti per la fissazione cellulare. Incubare le cellule in 100 microlitri di permeabilizzazione a base di saponina e lavare il reagente per 15 minuti.
Aggiungere 500 microlitri del cocktail di reazione e incubare per 30 minuti al buio. Dopo il lavaggio, risospendere le cellule in 100 microlitri di permeabilizzazione a base di saponina e reagente di lavaggio. Identificare le celle di interesse in base alle loro proprietà FSEA e SSEA.
Quindi tracciare FSEA e FSEH per escludere dall'analisi i doppietti e i grumi cellulari. Tracciare un'area del filtro passa-banda di emissione da 525 a 50 nanometri e SSCA per rimuovere le cellule morte. Utilizzando grafici di densità del filtro passa-banda di emissione da 530 a 30 e da 575 a 26 nanometri, è possibile rilevare la positività delle cellule per CD8a e CD3.
Analizza le celle per l'incorporazione di Alexa Fluor 647 EdU in un istogramma a parametro singolo utilizzando un filtro di emissione passa banda da 660 a 620 nanometri. Le cellule dendritiche CD11c positive hanno inghiottito efficacemente le cellule tumorali apoptotiche MCA205 a 37 gradi Celsius, dimostrando una fagocitosi dipendente dalla temperatura nelle prime fasi del ciclo di immunità al cancro. Dopo la fagocitosi, le cellule dendritiche hanno mostrato un aumento dei livelli di CD86 e MHC-II insieme a livelli ridotti di PDL1.
L'espansione clonale delle cellule T CD8 positive, una volta attivate da cellule dendritiche mature, era evidente con un tasso di proliferazione di circa il 20%. Utilizzando modelli tumor-on-chip, è stata osservata la risposta chemiotattica di queste cellule T nei confronti delle allarmine rilasciate dalle cellule tumorali.
