Dopo aver recuperato i CD8 cross-primed dalla cocoltura, centrifugarli a 1100 g per 10 minuti in 10 millilitri di terreno di coltura completo. Risospendere 1 x 10 alla potenza di 7 cellule totali in 100 microlitri di microsfere per la rimozione delle cellule morte e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Posizionare le colonne di separazione nel separatore magnetico e sciacquarle con un tampone legante.
Trasferire le sospensioni cellulari nelle colonne di separazione e raccogliere il flusso. Dopo aver lavato la colonna, raccogliere le cellule non marcate che passano attraverso e combinarle con il flusso precedentemente raccolto. CD8 vivo arricchito con centrifuga a 1100 g per cinque minuti in un terreno di crescita completo.
Dopo il conteggio, coltivare cellule CD8 con primer incrociato con cellule MCA205 fresche in un rapporto di due a uno in piastre a 12 pozzetti e incubare a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 72 ore. Prima di recuperare l'effettore CD8, aggiungere monensina e brefeldina alle cocolture di cellule immunitarie tumorali per sei ore. Quindi recuperare l'effettore CD8 e centrifugare due volte a 1100 g per cinque minuti.
Risospendere le cellule in tre diverse miscele di anticorpi primari preparate in tampone FACS freddo e incubare per 20 minuti a quattro gradi Celsius, proteggendole dalla luce. Aggiungere 100 microlitri di soluzione di fissazione al palato cellulare dal Mix C e incubare per 20 minuti a quattro gradi Celsius al buio. Risospendere le cellule in un tampone di lavaggio a freddo e incubare per 30 minuti a quattro gradi Celsius.
Dopo aver lavato le cellule due volte nel tampone FACS, aggiungere 100 microlitri di PBS contenente il colorante Vitality Fixable Aqua ai pellet cellulari per 30 minuti. Identifica le cellule di interesse in base alle loro proprietà FSCA e SSCA. Quindi tracciare FSCA e FSCH per escludere dall'analisi i doppietti e i grumi cellulari.
Tracciare il filtro passa-banda di emissione a 525/50 nanometri e SSCA per rimuovere le cellule morte, utilizzando filtri passa-banda di emissione a 660/20 e 780/60 nanometri, rilevare la positività cellulare per CDAA e CD3 in due grafici di densità dei parametri. Inoltre, analizzare le cellule per i marcatori CD44, CD25 e CD69 per il marcatore CD137 e per l'interferone gamma positivo e il granzima B per la miscela A, B e C, rispettivamente. Per il test di uccisione tumorale, integrare il terreno di cocoltura con un colorante di quantificazione della morte cellulare in tempo reale.
Dopo aver riscaldato la piastra a 37 gradi Celsius nel sistema di analisi delle cellule vive, eseguire la scansione dei dati ogni due ore per un massimo di 72 ore. Centrifugare le celle due volte a 1000 g per cinque minuti. Colorare le cellule per marcatori di superficie con 20 microlitri di tampone FACS freddo e incubare per 20 minuti a quattro gradi Celsius al buio.
Quindi aggiungere il colorante vitality propidium iodure per colorare le cellule per una strategia di gating. Identifica le celle di interesse in base alle loro proprietà FSCA e SSCA. Quindi tracciare FSCA e FSCH per escludere dall'analisi i doppietti e i grumi cellulari.
Utilizzare un filtro passa-banda di emissione a 450/50 nanometri per rilevare le cellule tumorali negative per CD45. In un istogramma a parametro singolo, utilizzando un filtro di emissione passa-banda a 610/620 nanometri, analizzare le cellule per l'incorporazione di ioduro di propidio come intensità fluorescente media. Attraverso la citometria a flusso multiparametrica, sono stati migliorati i livelli di espressione superficiale del marcatore di attivazione precoce CD69, dei marcatori di attivazione tardiva CD44 e CD25, dell'espressione di membrana di CD137 e CD107, dei marcatori di reattività tumorale.
I livelli intracellulari delle molecole citotossiche, del granzima B e dell'interferone gamma positivo sono aumentati progressivamente e significativamente, raggiungendo un picco di espressione a 72 ore di cocoltura. Le cellule MCA205 co-coltivate affini hanno subito livelli significativi di morte mediata da CD8 effettore.
