Per iniziare, ottenere 250 milligrammi di SAT sopra il muscolo principale pettorale durante l'impianto di CIED in una soluzione di stoccaggio tissutale attivata magneticamente. Preparare un milligrammo per millilitro di Collagenasi/Dispasi in 10 millilitri di soluzione salina bilanciata fredda di Hanks. Sotto una cappa a flusso laminare, tritare i tessuti in pezzi di un millimetro cubo in 500 microlitri di soluzione di collagenasi/dispasi.
Aggiungere 4,5 millilitri della soluzione di collagenasi/dispasi alla miscela e trasferire il tessuto triturato in una provetta da centrifuga pulita da 50 millilitri. Lavare il coperchio della capsula di Petri con cinque millilitri di soluzione di collagenasi/dispasi e aggiungerlo al tubo. Incubare il tubo per 30 minuti a 37 gradi Celsius in un rotatore per tubi impostato a 20 giri al minuto.
Per fermare la digestione, versare 10 millilitri di terreno di coltura delle cellule endoteliali complete nel tubo. Dopo aver triturato la miscela digerita con una cannula Venflon calibro 14, filtrarla attraverso un setaccio cellulare da 70 micrometri e sciacquarla con 10 millilitri di tampone PBS-BSA allo 0,5%. Centrifugare il filtrato a 300 G per 10 minuti a temperatura ambiente ed eliminare il surnatante.
Per rimuovere le cellule morte, aggiungere 200 microlitri di perle per la rimozione delle cellule morte al pellet di cellule prelevato in una provetta da microcentrifuga e incubare. Quindi collegare una colonna di separazione dei liquidi con un filtro da 30 micrometri al magnete separatore e posizionare una provetta da centrifuga da 15 millilitri al di sotto. Dopo aver lavato la colonna con il tampone legante per la rimozione delle cellule morte, aggiungere la sospensione del microscotto del campione.
Lascialo passare sotto gravità e raccogli l'eluato. Successivamente, centrifugare l'eluato di cellule vive raccolto e risospendere il pellet risultante in 400 microlitri di PBS-BSA allo 0,5%. Incubare le cellule sospese con 20 microlitri di perle magnetiche rivestite anti-CD31 a quattro gradi Celsius per 20 minuti.
Dopo la centrifugazione, risospendere il pellet cellulare in 500 microlitri di PBS-BSA allo 0,5%. Collegare una colonna con un filtro da 30 micrometri al magnete separatore e posizionare una provetta da centrifuga da 15 millilitri al di sotto. Aggiungere la sospensione di microsfere cellulari alla colonna e lasciarla passare attraverso per gravità.
Dopo aver lavato la colonna, metterla in una provetta da centrifuga fresca da 15 millilitri e aggiungere un millilitro di PBS-BSA allo 0,5% alla colonna. Spingere lo stantuffo della colonna per raccogliere la frazione CD31-positiva. Centrifugare il campione come dimostrato in precedenza e risospendere il pellet cellulare in un millilitro di terreno di crescita delle cellule endoteliali microvascolari complete.
Erogare la sospensione in due pozzetti di una piastra a 24 pozzetti rivestita di gelatina al 2%. Coltiva le cellule a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per due o quattro settimane fino a quando le cellule diventano quasi l'80% confluenti.
