Per ottenere la sospensione di una singola cellula dal cervello del neurone isolato, posizionare il cervello in un omogeneizzatore Dounce di vetro da 15 millilitri pre-raffreddato contenente una quantità appropriata di soluzione salina bilanciata di Hanks ghiacciata, o tampone HBSS. Usa il pestello Dounce sciolto per dissociare delicatamente e lentamente il tessuto cerebrale con circa 100-120 colpi di ghiaccio. Filtrare la sospensione di tessuto cerebrale risultante attraverso un filtro cellulare da 70 micron in una provetta da centrifuga da 50 millilitri.
Sciacquare la provetta Dounce con cinque millilitri di HBSS e procedere con la filtrazione per massimizzare la raccolta cellulare. Centrifugare la sospensione tissutale filtrata a 550 g per sei minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere il surnatante utilizzando un aspiratore sottovuoto e risospendere il palato cellulare in un millilitro di soluzione isotonica a gradiente di densità al 30%.
Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 15 millilitri. Aggiungere una quantità appropriata di soluzione con gradiente di densità al 30% e capovolgere delicatamente la provetta per garantire una miscelazione accurata. Centrifugare immediatamente la provetta a 845 g con accelerazione e freno impostati al livello tre per 20 minuti a quattro gradi Celsius.
Una volta fatto, rimuovere delicatamente la provetta dalla centrifuga senza agitare e aspirare con cura lo strato superiore di mielina utilizzando una punta da un millilitro collegata al vuoto. Quindi aspirare il surnatante, lasciando da uno a due millilitri, e risospendere il palato cellulare con un minimo di 10 millilitri di HBSS freddo. Centrifugare a 550 g per sei minuti a quattro gradi Celsius.
Lavare ancora una volta con un minimo di sette millilitri di HBSS freddo e centrifugare nuovamente. Dopo aver rimosso la maggior parte possibile del surnatante, risospendere le cellule in 100-200 microlitri di tampone per citometria a flusso per l'analisi della citometria a flusso.
