Per iniziare, preparare la soluzione di selenoproteina utilizzando il saggio di spostamento termico o il tampone TSA. erogare la proteina, le piccole molecole e il colorante SYPRO Orange nei pozzetti appropriati di una piastra da 384 pozzetti. Coprire la piastra con una pellicola adesiva otticamente trasparente e girare brevemente la piastra a 1.000 g per un minuto in una centrifuga.
Quindi posizionare la piastra in una macchina per PCR in tempo reale e programmarla in modo da mantenere il campione a 20 gradi Celsius per due minuti, seguito da un aumento di 0,5 gradi della temperatura al minuto fino a 95 gradi Celsius. Esportare i dati dalla macchina RT PCR per le unità di fluorescenza relative o RFU rispetto alla temperatura. Utilizzando il software preferito, è possibile estrarre e tracciare i punti dati fino all'intensità massima misurata per ogni curva di fusione.
Determinare la temperatura di fusione con l'adattamento sigmoidale di Boltzmann per i dati per determinare la temperatura di fusione o Tm.Le curve di denaturazione termica hanno indicato un aumento di quattro gradi Celsius di Escherichia nella stabilità termica di Escherichia coli SelO in presenza di ATP con ioni magnesio e un aumento di 12 gradi Celsius nello stesso per ATP con ioni manganese. Tuttavia, non vi è stato alcun cambiamento nella stabilità termica dopo l'incubazione con UTP, indicando che Escherichia coli SelO potrebbe non mostrare un legame rilevabile con UTP. I controlli senza proteine e senza colorante avevano un segnale di fluorescenza basso, che non rispondeva all'aumento della temperatura.
