Per iniziare, prendi un piatto di vetro con un coperchio ben aderente. Metti un batuffolo di cotone nel piatto. Sotto una cappa aspirante, aggiungi da tre a cinque millilitri di etere etilico al batuffolo di cotone.
Coprire immediatamente il piatto con il coperchio. Usa un pennello per raccogliere le larve di drosophila del terzo stadio dalle fiale di mosca. Trasferisci una larva in un piccolo contenitore aperto.
Mettere il contenitore nel piatto di vetro con etere etilico e chiudere immediatamente bene il piatto. Utilizzare un microscopio da dissezione per controllare la mobilità della larva ogni 30 secondi. Trasferire la larva anestetizzata su un vetrino da microscopio.
Immergere le larve in una goccia di soluzione salina per insetti. Al microscopio da dissezione. Rimuovere la maggior parte della soluzione salina con un fazzoletto di carta.
Posizionare la larva con il lato dorsale rivolto verso l'alto per l'ablazione con fibre giganti o con il lato ventrale rivolto verso l'alto per l'ablazione TTMn. Quindi abbassare lentamente un vetrino di copertura sulla larva. Aggiungere soluzione fisiologica sul lato del vetrino coprioggetto.
Per riempire lo spazio tra il vetrino e il vetrino coprioggetti. Per l'ablazione con fibre giganti, controllare il posizionamento del cervello ad alto ingrandimento al microscopio da dissezione. Assicurati che il cervello sia sdraiato a livello e sia visibile attraverso la cuticola.
Per spostare il tessuto adiposo che copre il cervello, utilizzare una pinza per applicare una leggera pressione sul vetrino coprioggetti e spostare il vetrino coprioggetti da un lato all'altro. Posizionare il campione su un tavolino per microscopio multifotone. Utilizzare il filtro GFP per localizzare il campione in modalità epifluorescenza.
Per l'ablazione delle fibre giganti, concentrarsi sulle cellule di interesse, quindi passare alla modalità a due fotoni. Impostare il laser a 870 nanometri e regolare il guadagno del rivelatore per visualizzare le cellule che esprimono GFP con lo scanner Galvano, definire l'area per l'ablazione utilizzando una regione circolare di interesse. Successivamente, procedere con l'impostazione del protocollo di ablazione nel software, per fare ciò, impostare in sequenza un frame di acquisizione, la stimolazione, seguito da un altro frame di acquisizione.
Avviare la potenza del laser di stimolazione a un valore inferiore ed eseguire il protocollo di stimolazione. Se l'ablazione non ha avuto successo e si limita a sbiancare la cellula, aumentare la potenza del laser con incrementi del 5% o il numero di loop uno alla volta ed eseguire nuovamente il protocollo. Fallo fino a quando non si vede che l'ablazione cellulare è riuscita.
Dopo aver ablato con successo la cella, rimuovere il vetrino coprioggetto. Con un pennello, prelevare delicatamente le larve dal vetrino, quindi trasferire le larve in una fiala di cibo. In campioni di ablazione di fibre giganti.
L'ablazione è stata verificata attraverso l'assenza di un soma marcato con GFP sul lato ablato del cervello. Per le larve ablate TTMn. L'assenza di TTMn su un lato è stata facilmente riconosciuta a causa della mancanza di soma e dendriti.
