Per iniziare, lavare il campione fresco dell'atrio umano in una lastra di vetro da 100 millimetri contenente HBSS sterile. Agitare delicatamente i campioni nella piastra per rimuovere eventuali residui di sangue. Trasferire il campione su una piastra da 100 millimetri bagnata con un piccolo volume di HBSS.
Con i bisturi incrociati, tagliare il campione in cubetti di due millimetri. Quindi, trasferire quattro piccoli frammenti miocardici su una piastra da 35 millimetri. Posizionare un vetro di copertura sterile sui frammenti e applicare una leggera pressione.
Pipettare 1,5 millilitri di DMEM nella piastra. Quindi incubare le piastre di coltura a 37 gradi Celsius, con un'integrazione di anidride carbonica del 5%. Quando le colture hanno raggiunto l'85% di confluenza, rimuovere la piastra dall'incubatrice e utilizzare una pinza sterile per sollevare il vetro di copertura.
Quindi posizionarlo a testa in giù su un nuovo piatto da 35 millimetri. Quindi aggiungere PBS sterile per risciacquarlo. Ora rimuovi i frammenti di miocardio.
Quindi pipettare il DMEM dalla piastra. Utilizzare PBS sterile per risciacquare la piastra contenente le cellule cresciute. Dopo aver eliminato il risciacquo, aggiungere un millilitro di tripsina EDTA allo 0,25% a ciascuna piastra e incubare le piastre a 37 gradi Celsius, con il 5% di anidride carbonica, per cinque minuti.
Dopo l'incubazione, rimuovere le piastre dall'incubatrice e utilizzare un microscopio per confermare il distacco delle cellule. Quindi, aggiungi due millilitri di soluzione di arresto della tripsina, o TSS, in ciascuna piastra per bloccare la tripsinizzazione. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta sterile da 15 millilitri.
Centrifugare a 400 g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Aspirare il surnatante utilizzando una pipetta sierologica da cinque millilitri. Quindi aggiungere tre millilitri di DMEM al pellet e rimetterlo in sospensione.
Posizionare la sospensione cellulare su una piastra da 60 millimetri. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius, con un'integrazione di anidride carbonica del 5%. Quindi, pipettare tre millilitri di soluzione sterile di gelatina allo 0,2% su ciascuna piastra da 60 millimetri.
Dopo l'incubazione, aspirare la soluzione e aggiungere tre millilitri di PBS sterile fino a nuovo utilizzo. Estrarre la piastra contenente i fibroblasti cardiaci dall'incubatrice. Rimuovere il DMEM dalla piastra e risciacquare con PBS sterile.
Dopo aver eliminato il risciacquo, aggiungere un millilitro di tripsina EDTA allo 0,25% su ciascuna piastra. Utilizzare un microscopio per confermare il distacco delle cellule. Quindi, aggiungi due millilitri di TSS in ogni piastra Per bloccare la tripsinizzazione.
Trasferire la sospensione cellulare in una provetta sterile da 15 millilitri. Centrifugare a 400 g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Aspirare il surnatante utilizzando una pipetta sierologica da cinque millilitri.
Quindi aggiungere tre millilitri di DMEM al pellet e rimetterlo in sospensione. Rimuovere il PBS dalla piastra gelatinosa da 60 millimetri e posizionare la sospensione cellulare nella piastra. Coltivare i fibroblasti in uno stato di confluenza per un massimo di 21 giorni.
Dopo 21 giorni di coltura, aspirare il terreno di coltura. Quindi sciacquare le piastre con tre millilitri di PBS. Dopo aver aspirato il PBS e aggiunto un millilitro di soluzione di decellularizzazione, osservare la piastra al microscopio a contrasto invertito.
Dopo due minuti, pipettare delicatamente quattro millilitri di PBS per diluire la soluzione di decellularizzazione nelle piastre. Aspirare la soluzione diluita. Quindi sciacquare delicatamente le piastre con PBS.
Infine, aggiungere un millilitro di PBS alle piastre. Conservare le piastre rivestite di matrice extracellulare a quattro gradi Celsius fino a nuovo utilizzo. La crescita dei fibroblasti dai piccoli frammenti di miocardio nativo posti in coltura è stata osservata entro tre-cinque giorni.
La decellularizzazione ha provocato il rivestimento della matrice extracellulare sulla superficie della piastra. La composizione e l'architettura della matrice extracellulare cardiaca prodotta in vitro sono state preservate grazie alla decellularizzazione.
