Caricamento di cellule T CD4⁺ primarie di topo e rivestimento di biglie magnetiche di proteina G con anticorpi per l'imaging locale di Ca²⁺

Per iniziare, prendi le cellule T CD4-positive isolate dai linfonodi e dalla milza di topo. Centrifugare da due a cinque milioni di cellule per cinque minuti a 300 g. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 480 microlitri di terreno di cellule T contenente 10 micromolari di Fluo-4 AM e 20 micromolari di Fura Red AM. Coprire la provetta Falcon con un foglio di alluminio e incubare le celle per 20 minuti a temperatura ambiente al buio.

Quindi aggiungere due millilitri di terreno di coltura delle cellule T alle cellule e continuare l'incubazione per altri 30 minuti. Mescolare delicatamente la sospensione di microsfere magnetiche Protein G e trasferire 12,5 microlitri in un nuovo tubo. Posiziona il tubo su un supporto magnetico per consentire alle perline di migrare verso il magnete.

Pipettare delicatamente il buffer di conservazione dal lato opposto del magnete per rimuoverlo. Per rimuovere l'eventuale buffer di stoccaggio rimanente, aggiungere 500 microlitri di PBST e agitare per 10 secondi. Riposizionare il tubo sul supporto magnetico e rimuovere il tampone.

Per rivestire le perle con anticorpi, risospenderle in 7,5 microlitri di PBST e aggiungere cinque microlitri ciascuno di anti-CD3 e anti-CD28. Incubare per 30-60 minuti mescolando continuamente a temperatura ambiente. Lavare le perle rivestite tre volte con 500 microlitri di PBST, seguito da un lavaggio con 500 microlitri di tampone di calcio utilizzando il supporto magnetico, quindi risospendere le perle in 200-400 microlitri di tampone di calcio.