Rilevamento di microdomini Ca²⁺ a livello subcellulare in cellule T murine primarie mediante microscopia a fluorescenza

Per iniziare, posizionare 10 microlitri di cellule CD4+ caricate sul vetrino preparato e lasciarle attaccare per tre-cinque minuti. Aggiungere delicatamente 80 microlitri di tampone per la misurazione del calcio al vetrino. Seleziona l'obiettivo a immersione in olio 100X.

Applicare una piccola goccia di olio da immersione e posizionare il vetrino sul tavolino del microscopio. Quindi regolare la messa a fuoco in modalità campo chiaro. Seleziona un campo visivo con un massimo di 10 celle che non sono in contatto tra loro e acquisisci un'immagine.

Quindi, aggiungere 10 microlitri di perle rivestite di anticorpi o stimolante dopo un minuto e misurare per un totale di tre minuti utilizzando 40 fotogrammi al secondo o la massima frequenza di fotogrammi possibile. Usa il cursore per individuare il tempo di contatto tra una perlina e una cella di interesse. Nel menu Opzioni sul lato destro, selezionare il contatto del cordone: x, y, t.

Seleziona il punto sul lato sinistro dell'immagine in cui la cella e il cordone entrano in contatto. Seleziona Scegli cella facendo clic su un punto all'interno. Fare clic sulla cellula stimolata da questa perlina, preferibilmente al centro.

Fare clic su AGGIUNGI contatto perlina. Una volta definiti tutti i contatti delle microsfere, fare clic sul pulsante Continua e procedere con i file aggiuntivi Le cellule di tipo selvatico hanno mostrato una rapida formazione di microdomini di calcio entro il primo secondo dopo la stimolazione, che si è espansa in tutta la cellula nei successivi 15 secondi. Al contrario, le cellule mutanti P2x4 e P2x7 hanno mostrato una ridotta formazione di microdomini di calcio con le cellule mutanti P2x4 che presentavano anche un livello basale più basso prima della stimolazione.

Come le cellule T mure, i microdomini di calcio sono stati osservati nel sito di contatto delle perle nelle cellule CD4+T umane.