Per iniziare, posiziona i trofozoiti di Naegleria gruberi congelati a 37 gradi Celsius per tre minuti. Coltivare i trofozoiti in PYNFH media a 25 gradi Celsius fino a circa l'80% di confluente. Posizionare il pallone confluente sul ghiaccio per cinque-10 minuti per rilasciare i trofozoiti aderiti dalla plastica.
Quindi agitare delicatamente il pallone per rimuovere le cellule aderenti rimanenti. Sostituire il terreno con terreni di incistamento sterili per incistare le cellule di Naegleria gruberi. Trascorse 48 ore, rimuovere le cisti dal pallone.
Centrifugare le cisti a 600 x g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, risospendere le cisti in due millilitri di terreno PYNFH con il 10% di siero fetale di vitello per asportare le cellule. Incubare le cisti a 25 gradi Celsius per 72 ore fino a quando i trofozoiti emergono e raggiungono l'80% di confluenza.
Per trasfettare i trofozoiti, prima impiattare un millilitro di trofozoiti in una piastra di coltura tissutale a fondo piatto a sei pozzetti. Quindi, incubare la miscela di reagenti per trasfezione plasmidica a temperatura ambiente per 10 minuti. Pipettare circa 800 microlitri di terreno dai monostrati di trofozoiti appena prima della trasfezione.
Quindi aggiungere 200 microlitri della miscela di reagenti di trasfezione plasmidica ai trofozoiti. Agitare delicatamente la lastra ogni 15 minuti per evitare che il supporto si aggreghi ai bordi della lastra e si secchi. Dopo un'ora, aggiungere 10 unità di DNasi in un millilitro di tampone DNasi 10X e aggiungerlo ai pozzetti.
Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per 15 minuti per rimuovere il DNA plasmidico residuo. Ora lava la piastra una volta con un millilitro di terreno di coltura, quindi aggiungi due millilitri di terreno fresco. Incubare la piastra a 25 gradi Celsius per 24-36 ore.
Al termine dell'incubazione, dividere il contenuto di un pozzetto in una nuova piastra in un rapporto 1:2. Quindi raccogliere i trofozoiti dai pozzetti rimanenti per ulteriori analisi. I trofozoiti di Naegleria gruberi erano ameboidi e aderenti ai fiaschi di coltura in condizioni di coltura standard.
La loro incubazione sul ghiaccio ha portato a trofozoiti rotondi e non aderenti. L'incubazione dei trofozoiti nei mezzi di incistamento ne ha causato l'incistazione.
