Per iniziare, aggiungere 200 microlitri di cloruro di sodio 100 millimolare a un tubo contenente trofozoiti trasfettati di naegleria gruberi. Centrifugare la provetta a 600 G per 10 minuti a 4 gradi Celsius. Dopo aver rimosso il surnatante, risospendere il pellet cellulare in 100 microlitri di EDTA da 100 millimolari.
Mettere la provetta in un blocco termico per 15 minuti a 98 gradi Celsius per lisare le cellule. Centrifugare la provetta a 4 gradi Celsius per 10 minuti alla massima velocità per pellettare i detriti. Trasferire il surnatante in una nuova provetta.
Quindi, aggiungere 0,5 volumi di acetato di ammonio, tre volumi di etanolo assoluto e un microlitro di glicogeno al surnatante. Capovolgere la provetta più volte per mescolare, prima di incubarla a meno 80 gradi Celsius per 30 minuti o durante la notte. Dopo l'incubazione, centrifugare le provette a temperatura ambiente per 10 minuti a 16.000 G.
Rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet e aggiungere 200 microlitri di etanolo al 70% per lavarlo prima della centrifugazione. Risospendere il pellet essiccato in acqua deionizzata sterile per ottenere una densità di trofozoiti di 10.000 trofozoiti per microlitro. Dopo la PCR con primer specifico per il DNA trasfettato e la rilevazione dei trofozoiti trasformati, aggiungere due microlitri di colorante di caricamento 6X ai campioni di CERE.
Quindi, caricare i campioni colorati su un gel di agarosio allo 0,8%. Dopo l'elettrofluorescenza del gel per 1,5-2 ore, incubarlo in colorante di DNA diluito in 100 millilitri di acqua deionizzata. Trasferire il gel colorato in acqua deionizzata per 20 minuti per decolorarlo.
Visualizza il gel su un sistema a luce ultravioletta per documentare i risultati. L'analisi PCR ha mostrato che pGRUB è stato rilevato nei trofozoiti trasfettati attraverso almeno sette passaggi. pGEM è andato perso dopo il primo passaggio, indicando che il plasmide vuoto non è stato trattenuto dalle amebe.
