Per iniziare, coltiva le MSC in una piastra a sei pozzetti con il terreno MSC umano contenente l'1% di penicillina e streptomicina. Procedere quindi con la marcatura delle cellule ARPE19 Mito-RFP con traccia cellulare viola nella membrana citoplasmatica. Per fare ciò, aggiungere 20 microlitri di dimetilsolfossido a una fiala di reagente viola per tracce cellulari e mescolare bene immediatamente prima dell'uso.
Far crescere le cellule ARPE19 Mito-RFP alla densità desiderata dall'80 al 90%Per preparare la soluzione di caricamento, diluire la soluzione madre viola della traccia cellulare in DPBS preriscaldato. Quindi rimuovere il terreno di coltura dalle cellule e sostituirlo con un millilitro di soluzione di caricamento. Incubare le cellule per 10 minuti a 37 gradi Celsius.
Al termine dell'incubazione, rimuovere la soluzione di caricamento. Dopo aver lavato le celle due volte con DPBS, aggiungere due millilitri di terreno fresco e completo. Quindi incubare le cellule per almeno 10 minuti a 37 gradi Celsius per consentire alla traccia cellulare viola di subire l'idrolisi dell'acetato.
Quindi, preparare una piastra a 24 pozzetti aggiungendo 50 microlitri di DPBS in ciascun pozzetto. Inserire il vetro di copertura nella piastra e lasciarlo riposare per un minuto. Rimuovere il DPBS dai pozzetti utilizzando una pressione negativa per assicurarsi che il vetrino del coperchio sia vicino al fondo del piatto.
Una volta che la densità cellulare raggiunge l'80-90%, rimuovere il terreno originale e lavare le cellule una volta con DPBS, aggiungere un millilitro della miscela di tripsina EDTA DPBS e incubare per tre o quattro minuti a 37 gradi Celsius. Quindi picchiettare delicatamente la piastra a sei pozzetti per staccare le cellule aderenti. Aggiungere un millilitro di terreno fresco e completo per terminare la digestione.
Successivamente, risospendere delicatamente tutte le cellule con una pipetta e trasferire tutte le cellule raccolte in una provetta da centrifuga da 15 millilitri. Centrifugare ora le celle a 200 G per cinque minuti. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in un millilitro di terreno fresco.
Porre 10 microlitri di sospensione cellulare su una piastra di conteggio per il conteggio. Dopo aver seminato le cellule MSC e ARPE19 nella piastra a 24 pozzetti, osservare le cellule al microscopio. Agitare la piastra fino a quando le cellule non sono distribuite uniformemente.
Incubarli nella coltura per 24 ore. Per la co-coltura indiretta, vedere 10.000 cellule ARPE19 in 500 microlitri di terreno per pozzetto di una piastra a 24 pozzetti. Posizionare l'inserto nel pozzetto in cui sono state seminate le cellule.
Semina 10.000 cellule staminali mesenchimali in 100 microlitri di terreno nella camera cellulare superiore per pozzetto.
