Per iniziare, prendere le cellule MSC-Mito-GFP e ARPE19-Mito-RFP in co-coltura e rimuovere il terreno dalle piastre a 24 pozzetti. Lavare tutte le cellule una volta con 500 microlitri per pozzetto di poliformaldeide al 4%. Aggiungere 500 microlitri di poliformaldeide fresca al 4% e fissare i campioni per 20 minuti.
Quindi rimuovere il fissativo e lavare i campioni tre volte per 10 minuti ciascuno con DPBS. Dopo aver rimosso il PBS, aggiungere 500 microlitri per pozzetto di soluzione bloccante e incubare per un'ora a temperatura ambiente. Quindi rimuovere la soluzione bloccante.
Per preparare la soluzione colorante con falloidina, diluire la soluzione di conservazione 400x a 1x con PBS. Aggiungere 200 microlitri di soluzione colorante di falloidina in ogni pozzetto e incubare per un'ora a temperatura ambiente. Quindi recuperare la soluzione colorante e lavare i campioni per 10 minuti con DPBS.
Dopo aver rimosso il PBS, prelevare il vetro di copertura con un ago da siringa e lasciarlo asciugare all'aria. Applicare una piccola quantità di mezzo di montaggio sulla diapositiva e capovolgere con cautela il vetro di copertura sulla diapositiva per assicurarsi che il mezzo ricopra uniformemente l'intera superficie. Sigillare i bordi con lo smalto.
Sono stati osservati nanotubi a effetto tunnel o strutture di TNT, stabilendo connessioni intercellulari tra tipi di cellule simili e diversi. Il trasferimento mitocondriale è stato osservato in cellule ARPE-19 contenenti fluorescenza punteggiata verde da MSC e in MSC contenenti fluorescenza punteggiata rossa da cellule ARPE-19. L'imaging a super risoluzione ha confermato la formazione di TNT e il trasferimento mitocondriale dettagliato tramite TNT.
La quantificazione ha mostrato che le MSC erano significativamente più capaci di donare mitocondri rispetto alle cellule ARPE-19.
