Per iniziare, procurarsi il vetrino montato sul campione dopo averlo invecchiato. Per pretrattare il vetrino, immergerlo in serie in barattoli di coplin contenenti soluzioni appropriate per il tempo specificato. Digerire il tessuto con 100-200 microlitri di tampone digestivo proteinasi K e incubare a temperatura ambiente per un minuto.
Per fermare la digestione, immergere immediatamente il vetrino in serie in soluzioni di etanolo per due minuti ciascuna. Applicare la miscela di ibridazione FISH sul vetrino e coprire il campione con un vetrino coprioggetti. Posizionare i vetrini su una piastra riscaldante, come un sistema di ibridazione Slide Moat a 75 gradi Celsius per due-cinque minuti.
Quindi trasferire il vetrino su un'altra piastra riscaldante impostata a 37 gradi Celsius per ibridare durante la notte. Quindi, immergere il vetrino nel tampone di lavaggio caldo e rimuovere con cautela il vetrino coprioggetti. Lavare e colorare il vetrino utilizzando reagenti appropriati al buio.
Immergi rapidamente il vetrino in acqua deionizzata per non più di un secondo e posizionalo su un tovagliolo di carta. Dopo l'asciugatura, montare la diapositiva con un supporto di montaggio anti-sbiadimento. Posizionare il vetrino coprioggetto e sigillarlo con smalto per unghie prima dell'imaging.
Utilizzando una lente a olio 60X, cattura il segnale fluorescente in più Z-stack. Infine, esegui una proiezione 3D massima per ottenere la migliore risoluzione e applica la deconvoluzione o altri algoritmi di cancellazione dello sfondo. Nei campioni di carcinoma mammario triplo negativo, la FISH nucleare mostra principalmente due punti distinti per nucleo, che rappresentano i suoi due segnali ERBB2.
Al contrario, i campioni HER2-positivi mostrano abbondanti segnali FISH, indicando diversi modelli di amplificazione genica. Inoltre, alcuni nuclei in campioni HER2-positivi possono mostrare cluster, suggestivi di hub di DNA extra cromosomico, che sono punti focali per una maggiore amplificazione genica.
