Per iniziare, sistemare il terreno di espansione appena preparato, filtrare le soluzioni di proteinasi e antibiotici sterilizzate e gli strumenti chirurgici sterilizzati sulla piattaforma di lavoro della cabina di biosicurezza. Aggiungi il collagene della coda di ratto in piastre di coltura da 100 millimetri e pozzetti trans da 24 millimetri. Lasciare i piatti aperti per una notte sotto la luce ultravioletta per la sterilizzazione.
Immergere il topo soppresso in etanolo al 75% per la sterilizzazione. Non immergere naso e bocca. Usando forbici chirurgiche e pinze, taglia e apri l'epidermide dalla mascella inferiore alla cavità addominale del topo.
Usando un altro set di forbici e pinze chirurgiche, strappare le ghiandole tiroidee su entrambi i lati e rimuovere le connessioni tra la trachea, il tessuto muscolare circostante e l'esofago. Quindi, taglia con cura il torace e usa il forcipe per scavare più a fondo nella cavità toracica. Rimuovi l'intero polmone e trova la fine della trachea.
Tagliare la trachea dalla cartilagine tiroidea al ramo bronchiale tracheale e metterla in un mezzo di espansione pre-freddo contenente quattro antibiotici. Agitare il tubo per sciacquare quanto più sangue possibile dalla superficie della trachea prima di metterlo sul ghiaccio. Ora trasferisci la trachea in PBS pre-freddo contenente quattro antibiotici.
Usando forbici chirurgiche e pinze, rimuovere coaguli e altri tessuti dalla superficie della trachea e tagliarli in un centimetro quadrato. Incubare il tessuto tracheale in soluzione di proteinasi a 37 gradi Celsius. Dopo 40 minuti, agitare più volte la provetta e utilizzare un colino cellulare da 40 micron per rimuovere i tessuti rimanenti.
Sciacquare la trachea tritata su un colino con cinque millilitri di terreno di espansione. Centrifugare la sospensione tracheale a 400 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius e risospendere il pellet in otto millilitri di mezzo di espansione. Contare le cellule vitali utilizzando il blu di tripano e l'emocitometro.
Sospensione cellulare su piastra P0 su un piatto da 100 millimetri, prerivestito con collagene di coda di ratto. Coltivare le cellule a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica.
