Una volta che le cellule epiteliali primarie delle vie aeree murine raggiungono l'80% di confluenza, le cellule si posizionano su un vetrino rivestito di collagene a coda di topo. Quindi, aggiungi la paraformaldeide per fissare le cellule per 12 ore. Lavare il vetrino tre volte con PBS per cinque minuti ciascuno e incubarlo con il 3% di albumina sierica bovina e lo 0,1% di Triton X-100 in PBS per un'ora.
Aggiungere l'anticorpo anti-pan citocheratina a una diluizione da uno a 500 sul vetrino e incubare per una notte a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, lavare il vetrino tre volte con una soluzione di PBS per cinque minuti ciascuna prima di incubarlo con l'anticorpo secondario a una diluizione da uno a 1.000 per due ore al buio. Dopo aver lavato il vetrino con PBS, aggiungere DAPI a una diluizione da uno a 1.000 e incubare per 15 minuti.
Lavare il vetrino una volta con PBS per cinque minuti. Osservare il vetrino al microscopio a fluorescenza per confrontare i pattern di espressione con un controllo positivo e un controllo negativo Dopo il distacco e la centrifugazione, risospendere le cellule della fase P2 in un volume appropriato di mezzo di espansione. Pipettare un millilitro di sospensione cellulare sulla camera apicale dell'inserto della membrana in policarbonato Transwell.
Aggiungere 1,5 millilitri di terreno di proliferazione al compartimento basale del Transwell. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius fino a raggiungere la confluenza. Preparare 50 millilitri di terreno di differenziazione completo utilizzando i seguenti componenti.
Far bollire una sigaretta attraverso 12,5 millilitri di mezzo di differenziazione, quindi filtrarla attraverso un filtro da 0,22 micron per preparare l'estratto di fumo di sigaretta o CSE. Per garantire la standardizzazione tra esperimenti e lotti di CSE, misurare l'assorbanza a 320 nanometri su uno spettrofotometro. Quindi, rimuovere il mezzo di espansione dalla camera apicale e basale di Transwells.
Aggiungere un terreno di differenziazione contenente una concentrazione appropriata di CSE per stimolare le cellule epiteliali primarie delle vie aeree murine per 28 giorni. Durante l'incubazione, lavare la camera apicale due volte alla settimana con PBS e sostituire il terreno nella camera basale con un terreno di differenziazione appena preparato contenente CSE. Le cellule epiteliali murine delle vie aeree si sono differenziate con successo in un'interfaccia aria-liquido in 28 giorni.
La presenza di cellule ciliate e caliciformi è stata dimostrata mediante saggio di immunofluorescenza rispettivamente del marcatore delle ciglia, dell'alfa tubulina acetilata e del marcatore caliciforme mucina 5AC. La vitalità cellulare a 24 ore con concentrazioni variabili di CSE ha dimostrato che le cellule epiteliali diminuivano quando la concentrazione era superiore al 6%L'attività cellulare sotto stimolazione a lungo termine non ha mostrato una morte cellulare significativa con concentrazioni di CSE del 2%4% e del 6%. Ma sono stati notati cambiamenti nella resistenza transmembrana e nelle cellule esfoliate.
Inoltre, è stata osservata una riduzione complessiva delle cellule differenziate e delle cellule ciliate quando le colture di cellule epiteliali delle vie aeree murine sono state esposte cronicamente a CSE.
