Questo studio è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (82090013).

Il protocollo complessivo richiede 44 giorni, di cui 1 giorno per la preparazione delle cellule epiteliali delle vie aeree isolate da trachee murine, 15 giorni per la proliferazione cellulare e 28 giorni per la stimolazione CSE all'interfaccia aria-liquido. Tutti gli animali da esperimento sono ospitati nella SPF Barrier Animal Room dell'Animal Experiment Center della Capital Medical University e sono stati esaminati e approvati dall'Animal Experiment and Laboratory Animal Ethics Committee della Capital Medical University (AEEI-2020-100) per soddisfare i requisiti delle linee guida ARRIVE7.
1. Isolamento di cellule epiteliali primarie delle vie aeree murine da trachee murine
<ol><li>Preparazione<ol><li>Preparare il terreno di espansione completo combinando 1 mL di integratore 50x e 0,05 mL di brodo di idrocortisone con 48,95 mL di terreno basale di espansione. Conservare a 4 °C e consumare entro 4 settimane.</li>
		<li>Sciogliere 7,5 mg di proteinasi e 5 mg di desossiribonucleasi I in 5 mL di F-12 di Ham per preparare una soluzione di proteinasi. Filtrarlo per sterilizzarlo e conservarlo a 4 °C e utilizzarlo entro 4 settimane.</li>
		<li>Preparare soluzioni antibiotiche aggiungendo 0,05 mL di 100x penicillina/streptomicina e 0,01 mL di 500x gentamicina/amfotericina a 5 mL di mezzo di espansione completo, PBS e soluzione di proteinasi (100 U/mL di penicillina, 100 U/mL di streptomicina, 10 μg/mL di gentamicina e 0,25 μg/mL di amfotericina B). Conservare a 4 °C e consumare entro 4 settimane.</li>
		<li>Sterilizzare gli strumenti chirurgici e preparare la cabina di sicurezza biologica per l'isolamento cellulare. Allo stesso tempo, assicurarsi che l'attrezzatura standard per la coltura cellulare sia pronta per l'uso.</li>
		<li>Preparare piastre rivestite di collagene con coda di ratto aggiungendo collagene di coda di ratto (100 μg/mL in acido acetico 0,02 N) in piastre di coltura da 100 mm e pozzetti da 24 mm (0,05 mL/cm2). Lasciare aperto per una notte sotto la luce UV per la sterilizzazione.</li>
	</ol></li>
	<li>Isolamento delle cellule epiteliali primarie delle vie aeree murine<ol><li>Utilizzare topi C57BL/6 (6-8 settimane, maschi, con SPF rialzato) per l'isolamento delle cellule epiteliali tracheali. Eutanasia con sovradosaggio di soluzione di pentobarbital sodico all'1% (circa 200 mg/kg). Usa cinque topi per una resa cellulare sufficiente.</li>
		<li>Sterilizzare il topo immergendolo in una soluzione di etanolo al 75%, non immergendo il naso e la bocca nell'alcol per evitare che l'alcol fluisca nella trachea.</li>
		<li>Seziona il mouse.<ol><li>Utilizzare lame e pinze chirurgiche, una serie di dispositivi per tagliare e aprire l'epidermide dalla mascella inferiore alla cavità addominale del topo.</li>
			<li>Usa un altro set di strumenti chirurgici per strappare le ghiandole tiroidee su entrambi i lati e rimuovere le connessioni tra la trachea, il tessuto muscolare circostante e l'esofago.</li>
			<li>Dopodiché, taglia con cura il torace, usa il forcipe per scavare più a fondo nella cavità toracica, estrai l'intero polmone e trova la fine della trachea.</li>
		</ol></li>
		<li>Elabora la trachea.<ol><li>Tagliare la trachea dalla cartilagine tiroidea al ramo tracheo-bronchiale e metterla in un terreno di espansione pre-freddo contenente quattro antibiotici.</li>
			<li>Agitare il tubo per sciacquare quanto più sangue possibile dalla superficie della trachea, tenerlo in ghiaccio e quindi iniziare l'intervento chirurgico per il topo successivo.</li>
		</ol></li>
		<li>Trasferire tutte le trachee raccolte in un tampone PBS pre-freddo contenente quattro antibiotici (200 U/mL di penicillina, 200 U/mL di streptomicina, 20 μg/mL di gentamicina e 0,5 μg/mL di amfotericina B) per il pretrattamento prima della digestione.</li>
		<li>Utilizzare una serie di strumenti chirurgici per rimuovere coaguli e altri tessuti dalle superfici della trachea, quindi tagliarli in una dimensione di 1 cm2 .</li>
		<li>Incubare il tessuto tracheale in soluzione di proteinasi a 37 °C per 40 min.</li>
		<li>Dopo 40 minuti, agitare più volte la provetta e utilizzare un colino cellulare da 40 μm per rimuovere i tessuti rimanenti. Sciacquare le trachee tritate su un colino con 5 ml di terreno di espansione, centrifugare la sospensione cellulare a 400 x g per 5 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante.</li>
		<li>Risospendere le cellule ottenute in 8 mL di terreno di espansione.</li>
		<li>Contare le cellule vitali utilizzando il blu di tripano e un emocitometro.</li>
		<li>Sospensione cellulare su piastra P0 su piastre da 100 mm (1 x 104 cellule vive/cm2) prerivestite con collagene di coda di ratto e coltura delle cellule in un incubatore a 37 °C, 5% CO2.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Coltura di espansione e passaggio di cellule epiteliali primarie delle vie aeree murine
<ol><li>Sostituire il terreno per la coltura cellulare P0 ogni 3 giorni fino a quando le cellule raggiungono la confluenza del 70%-80%, di solito entro 6 giorni. A questo punto, le cellule epiteliali tracheali murine possono formare un monostrato intatto con un aspetto di ciottoli (Figura 1A-D).</li>
	<li>Preriscaldare volumi sufficienti di PBS, terreno di espansione completo e kit di dissociazione cellulare privo di componenti animali (ACF) a 37 °C.</li>
	<li>Sciacquare delicatamente le cellule con 3 ml di PBS.</li>
	<li>Eseguire la dissociazione enzimatica.<ol><li>Aggiungere 3 mL di soluzione di dissociazione enzimatica ACF alla piastra e incubare a 37 °C per 5 minuti. Dopo il pipettaggio, rimuovere delicatamente le cellule e trasferire la sospensione cellulare in 3 mL di soluzione di inibizione dell'enzima ACF.</li>
		<li>Ripetere l'aggiunta di 3 mL di soluzione di dissociazione enzimatica ACF e incubare nuovamente per 5 minuti per garantire il massimo distacco cellulare.</li>
	</ol></li>
	<li>Far girare la sospensione cellulare a 400 x g per 5 min a 4 °C. Scartare il surnatante.</li>
	<li>Risospendere le cellule in 1 mL di terreno di espansione.</li>
	<li>Contare le cellule vitali utilizzando il blu di tripano e un emocitometro.</li>
	<li>Sospensione cellulare su piastra P1 su diverse piastre da 100 mm (5 x 104 cellule vive/cm2) pre-rivestite con collagene di coda di ratto e coltura delle cellule in un incubatore a 37 °C, 5% CO2.</li>
</ol>3. Differenziamento e stimolazione CSE di cellule epiteliali primarie murine delle vie aeree all'interfaccia aria-liquido
<ol><li>Confermare il tipo di cella.<ol><li>Verificare l'origine epiteliale delle cellule isolate utilizzando un test di immunofluorescenza (IFA) con anticorpi contro le citocheratine. Seminare le cellule su vetrini rivestiti di collagene a coda di ratto e utilizzare la paraformaldeide per fissarle per almeno 12 ore dopo che le cellule hanno raggiunto l'80% di confluenza.</li>
		<li>Lavare i vetrini 3 volte con la soluzione di PBS per 5 minuti e incubarli con il 3% di BSA e lo 0,1% di tritone X-100 in soluzione PBS a temperatura ambiente (RT) per 1 ora.</li>
		<li>Incubare i vetrini per una notte a 4 °C con anticorpo commerciale anti-pan citocheratina alla diluizione di 1:500.</li>
		<li>Il giorno successivo, lavare i vetrini 3 volte con la soluzione di PBS per 5 minuti e incubarli con tampone anticorpale secondario a una diluizione di 1:1000 a RT per 2 ore al buio.</li>
		<li>Dopo l'incubazione, lavare i vetrini 3 volte con PBS (5 minuti per lavaggio) e aggiungere DAPI a una diluizione di 1:1000. Dopo l'incubazione in RT per 15 minuti, lavare una volta i vetrini con PBS per 5 minuti.</li>
		<li>Osservare i vetrini al microscopio a fluorescenza e confrontare i pattern di espressione con un controllo positivo (linea cellulare A549) e un controllo negativo (linea cellulare Raw264.7) (Figura 2).</li>
	</ol></li>
	<li>Semina le cellule per la differenziazione.<ol><li>Staccare e centrifugare le celle P2 come descritto in precedenza e risospendere il pellet della cella in un volume appropriato di mezzo di espansione per facilitare la placcatura di 1 x 104 cellule vive/cm2.</li>
		<li>Pipettare 1 mL di sospensione cellulare sulla camera apicale dell'inserto della membrana in policarbonato transwell. Al compartimento basale del pozzetto trans, aggiungere 1,5 mL di terreno di proliferazione.</li>
	</ol></li>
	<li>Incubare le cellule a 37 °C e cambiare completamente tutto il terreno nelle camere basale e apicale ogni 3 giorni utilizzando il terreno di espansione fino a raggiungere la confluenza. Questo richiede in genere 3-6 giorni.</li>
	<li>Preparare 50 mL di terreno di differenziazione completo aggiungendo 5 mL di ALI 10x Supplement, 500 μL di ALI Maintenance Supplement, 100 μL di soluzione di eparina e 250 μL di soluzione madre di idrocortisone a 44,15 mL di ALI Basal Medium.</li>
	<li>Prepara CSE.<ol><li>Far bollire una sigaretta attraverso 12,5 ml di terreno di differenziazione e poi filtrarla attraverso un filtro per pori da 0,22 μm per preparare il CSE. Per garantire la standardizzazione tra esperimenti e lotti di CSE, misurare l'assorbanza a 320 nm su uno spettrofotometro e definire la densità ottica (OD) di 1 come 100%8.</li>
	</ol></li>
	<li>Utilizzare il mezzo di differenziazione contenente un'adeguata concentrazione di CSE per stimolare le cellule epiteliali primarie delle vie aeree murine a rilevare gli effetti sulla differenziazione delle cellule.</li>
	<li>Lasciare che le cellule si differenzino per 28 giorni, durante i quali il mezzo della camera basale viene cambiato e il lato apicale viene lavato due volte a settimana rimuovendo il mezzo della camera apicale e sostituendo il mezzo della camera basale con il mezzo di differenziazione contenente la concentrazione appropriata di CSE.</li>
	<li>Analizza le cellule dopo l'esposizione.<ol><li>Dopo l'esposizione a un terreno di differenziazione contenente CSE, raccogliere le cellule e i surnatanti di coltura in qualsiasi momento (ad esempio, 0-28 giorni) per rilevare cambiamenti morfologici (ad esempio, saggio di immunofluorescenza (IFA) o colorazione con ematossilina-eosina (HE) o per procedure analitiche bioinformatiche (ad esempio, trascrittomica, proteomica, metabolomica, ecc.).</li>
	</ol></li>
</ol>

Modello in vitro di cellule epiteliali murine delle vie aeree ed esposizione cronica al fumo

<ol>
	<li>Ritchie, A. I., Martinez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+challenges+of+defining+early+chronic+obstructive+pulmonary+disease+in+the+general+population.">The challenges of defining early chronic obstructive pulmonary disease in the general population.</a> Am J Respir Crit Care Med. 203 (10), 1209-1210 (2021).</li><li>Caramori, G., Kirkham, P., Barczyk, A., Di Stefano, A., Adcock, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathogenesis+of+cigarette+smoking-induced+stable+COPD.">Molecular pathogenesis of cigarette smoking-induced stable COPD.</a> Ann N Y Acad Sci. 1340, 55-64 (2015).</li><li>Leino, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barrier+disrupting+effects+of+alternaria+alternata+extract+on+bronchial+epithelium+from+asthmatic+donors.">Barrier disrupting effects of alternaria alternata extract on bronchial epithelium from asthmatic donors.</a> PLoS One. 8 (8), e71278 (2013).</li><li>Benediktsd&#243;ttir, B. E., Arason, A. J., Halld&#243;rsson, S., Gudj&#243;nsson, T., M&#225;sson, M., Baldursson, &. #. 2. 1. 1. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+delivery+characteristics+of+the+progenitor+bronchial+epithelial+cell+line+VA10.">Drug delivery characteristics of the progenitor bronchial epithelial cell line VA10.</a> Pharm Res. 30 (3), 781-791 (2013).</li><li>Walters, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+human+airway+epithelium+derived+basal+cell+line+with+multipotent+differentiation+capacity.">Generation of a human airway epithelium derived basal cell line with multipotent differentiation capacity.</a> Respir Res. 14 (1), 135 (2013).</li><li>Prytherch, Z., Job, C., Marshall, H., Oreffo, V., Foster, M., B&#233;ruB&#233;, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+stem+cell+differentiation+in+an+in+vitro+airway+model.">Tissue-specific stem cell differentiation in an in vitro airway model.</a> Macromol Biosc. 11 (11), 1467-1477 (2011).</li><li>Kilkenny, C., Browne, W., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+research:+Reporting+in+vivo+experiments:+The+ARRIVE+guidelines.">Animal research: Reporting in vivo experiments: The ARRIVE guidelines.</a> Br J Pharmacol. 160 (7), 1577-1579 (2010).</li><li>Brekman, A., Walters, M. S., Tilley, A. E., Crystal, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOXJ1+prevents+cilia+growth+inhibition+by+cigarette+smoke+in+human+airway+epithelium+in+vitro.">FOXJ1 prevents cilia growth inhibition by cigarette smoke in human airway epithelium in vitro.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 51 (5), 688-700 (2014).</li><li>Bajic, M., Maher, K. A., Deal, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+open+chromatin+regions+in+plant+genomes+using+ATAC-seq.">Identification of open chromatin regions in plant genomes using ATAC-seq.</a> Methods Mol Biol. 1675, 183-201 (2018).</li><li>Shaykhiev, R., Crystal, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+events+in+the+pathogenesis+of+chronic+obstructive+pulmonary+disease.+Smoking-induced+reprogramming+of+airway+epithelial+basal+progenitor+cells.">Early events in the pathogenesis of chronic obstructive pulmonary disease. Smoking-induced reprogramming of airway epithelial basal progenitor cells.</a> Ann Am Thorac Soc. 11 Suppl 5 (Suppl 5), S252-S258 (2014).</li><li>Raby, K. L., Michaeloudes, C., Tonkin, J., Chung, K. F., Bhavsar, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+airway+epithelial+injury+and+abnormal+repair+in+asthma+and+COPD.">Mechanisms of airway epithelial injury and abnormal repair in asthma and COPD.</a> Front Immunol. 14, 1201658 (2023).</li><li>Zhou, J. -. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cigarette+smoke-initiated+autoimmunity+facilitates+sensitisation+to+elastin-induced+COPD-like+pathologies+in+mice.">Cigarette smoke-initiated autoimmunity facilitates sensitisation to elastin-induced COPD-like pathologies in mice.</a> Eur Respir J. 56 (3), 2000404 (2020).</li><li>Lam, H. C., Choi, A. M. K., Ryter, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mouse+respiratory+epithelial+cells+and+exposure+to+experimental+cigarette+smoke+at+air-liquid+interface.">Isolation of mouse respiratory epithelial cells and exposure to experimental cigarette smoke at air-liquid interface.</a> J Vis Exp. 48, 2513 (2011).</li><li>You, Y., Brody, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+differentiation+of+mouse+tracheal+epithelial+cells.">Culture and differentiation of mouse tracheal epithelial cells.</a> Methods Mol Biol. 945, 123-143 (2012).</li><li>Wandalsen, G. F., Lanza, F. d. e. C., Nogueira, M. C. P., Sol&#233;, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+chloral+hydrate+sedation+in+infants+for+pulmonary+function+tests.">Efficacy and safety of chloral hydrate sedation in infants for pulmonary function tests.</a> Rev Paul Pediatr. 34 (4), 408-411 (2016).</li><li>Jiang, D., Schaefer, N., Chu, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Air-liquid+interface+culture+of+human+and+mouse+airway+epithelial+cells.">Air-liquid interface culture of human and mouse airway epithelial cells.</a> Methods Mol Biol. 1809, 91-109 (2018).</li><li>Takagi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+prevent+contamination+with+Candida+albicans+during+the+fabrication+of+transplantable+oral+mucosal+epithelial+cell+sheets.">How to prevent contamination with Candida albicans during the fabrication of transplantable oral mucosal epithelial cell sheets.</a> Regen Ther. 1, 1-4 (2015).</li><li>Culp, D. J., Latchney, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucinlike+glycoproteins+from+cat+tracheal+gland+cells+in+primary+culture.">Mucinlike glycoproteins from cat tracheal gland cells in primary culture.</a> Am J Physiol. 265 (3 Pt 1), L260-L269 (1993).</li><li>Cao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invited+review:+human+air-liquid-interface+organotypic+airway+tissue+models+derived+from+primary+tracheobronchial+epithelial+cells-overview+and+perspectives.">Invited review: human air-liquid-interface organotypic airway tissue models derived from primary tracheobronchial epithelial cells-overview and perspectives.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 57 (2), 104-132 (2021).</li><li>Beb&#246;k, Z., Tousson, A., Schwiebert, L. M., Venglarik, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+oxygenation+promotes+CFTR+maturation+and+trafficking+in+MDCK+monolayers.">Improved oxygenation promotes CFTR maturation and trafficking in MDCK monolayers.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 280 (1), C135-C145 (2001).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La BPCO è una comune malattia infiammatoria cronica delle vie aeree. L'esposizione al fumo di tabacco porta all'infiammazione cronica delle vie aeree, al rimodellamento delle vie aeree e alla distruzione strutturale dei polmoni, che è il risultato dell'interazione di varie cellule strutturali e cellule immunitarie10. In quanto prima linea del sistema immunitario innato nel polmone, le cellule epiteliali delle vie aeree svolgono un ruolo molto importante durante lo sviluppo della malattia<sup cla...

La broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO) è una condizione polmonare eterogenea con caratteristiche complesse, mentre i pazienti con BPCO tendono gradualmente ad essere più giovani1. Il fumo, un fattore di rischio primario per la BPCO2, ha un profondo impatto sulle cellule epiteliali delle vie aeree, che fungono da barriera iniziale contro il fumo di tabacco. Nonostante questa associazione nota, i meccanismi dettagliati attraverso i quali il fumo di tabacco induce cambiamenti nelle cellule epiteliali delle vie aeree rimangono inadeguatamente esplorati. Una comprensione approfondita di queste alterazioni molecolari è essenziale per identificare i marcatori diagnostici precoci e i bersagli terapeutici per la BPCO.
Per colmare questa lacuna, abbiamo sviluppato un nuovo modello in vitro utilizzando cellule epiteliali murine delle vie aeree. Queste cellule sono state sottoposte a stimolazione a lungo termine con estratto di fumo di sigaretta (CSE), consentendoci di monitorare i cambiamenti cellulari dinamici ed esplorare i cambiamenti nelle cellule epiteliali delle vie aeree sotto stimolazione del tabacco a lungo termine e il meccanismo sottostante. In questo modello, il transwell è stato utilizzato per fornire l'interfaccia aria-liquido delle cellule epiteliali delle vie aeree e l'estratto di fumo di sigaretta è stato stimolato nella fase iniziale della differenziazione delle cellule epiteliali fino alla fine della differenziazione a 28 giorni. Studi precedenti hanno indagato solo la differenziazione e la stimolazione a breve termine delle cellule epiteliali delle vie aeree (dominanza della linea cellulare). Erano limitati a un unico percorso regolatorio 3,4,5,6. Tuttavia, il protocollo qui presentato utilizza cellule epiteliali primarie delle vie aeree di topo e ottimizza il processo di estrazione cellulare per una migliore attività cellulare rispetto ai precedenti metodi di coltura di cellule epiteliali delle vie aeree. Questo modello si concentra sulle alterazioni del differenziamento cellulare insieme ad analisi trascrittomiche, proteomiche, metabolomiche ed epigenomiche complete. Utilizzando l'immunofluorescenza e tecniche multi-omiche avanzate, abbiamo mirato a chiarire le risposte cellulari delle cellule epiteliali delle vie aeree all'esposizione cronica al fumo di tabacco, contribuendo così a una comprensione più profonda della patogenesi della BPCO. Questo modello può essere utilizzato per esplorare i cambiamenti nel modello di differenziazione delle cellule epiteliali delle vie aeree e il suo meccanismo causato dalla stimolazione a lungo termine di vari inquinanti.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100x Penicillin/Streptomycin solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 mm Transwell with 0.4 &#181;m Pore Polyester Membrane Insert, Sterile</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>TCS016012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500x Gentamicin/Amphotericin Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>R01510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetylated &#945;-Tubulin</td>
			<td>CST</td>
			<td>#5335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-&#945;-Tubulin (Lys40) (D20G3)XP Rabbit mAb&#160;</td>
			<td>cellsignal</td>
			<td>#5335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal Component Free Cell Dissociation Kit</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>05426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-pan Cytokeratin antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab7753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cigarette</td>
			<td>Marlboro</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Claudin3</td>
			<td>immunoway</td>
			<td>YT0949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclase I from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclase I from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#8217;s F-12</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N6658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Solution&#160;</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>07980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone Stock Solution</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>07925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mucin 5AC</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab212636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Occludin</td>
			<td>proteintech</td>
			<td>27260-1-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Cytosci</td>
			<td>CBS004S-BR500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-ALI 
			Basal Medium</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>05002&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-ALI 10x Supplement</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>05003&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-ALI Maintenance Supplement</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>05006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-Ex Plus 50x Supplement</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>05042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-Ex Plus Basal Medium</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>05041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase E</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat tail collagen</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>07050&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro model for studying differentiation and changes of multi-omics on murine airway epithelial cells stimulated with cigarette smoke extract

La broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO) è in gran parte attribuita all'esposizione al fumo di tabacco. Studiare come le cellule epiteliali delle vie aeree si adattano funzionalmente al fumo di tabacco è fondamentale per comprendere la patogenesi della BPCO. Il presente studio consisteva nella creazione di un modello in vitro utilizzando cellule epiteliali primarie delle vie aeree murine per imitare l'impatto del fumo di tabacco nella vita reale. A differenza delle linee cellulari consolidate, le cellule primarie conservano proprietà più simili a quelle in vivo, tra cui i modelli di crescita, l'invecchiamento e la differenziazione. Queste cellule mostrano una risposta infiammatoria sensibile e una differenziazione efficiente, rappresentando così da vicino le condizioni fisiologiche. In questo modello, le cellule epiteliali primarie delle vie aeree murine sono state coltivate per 28 giorni sotto un'interfaccia aria-liquido con una concentrazione ottimale di estratto di fumo di sigaretta (CSE), che ha portato alla trasformazione di un monostrato di cellule indifferenziate in un epitelio colonnare pseudostratificato, indicativo dell'acclimatazione al CSE. Sono state quindi applicate analisi multi-omiche complete per chiarire i meccanismi con cui la CSE influenza la differenziazione delle cellule delle vie aeree basali. Queste intuizioni forniscono una comprensione più profonda dei processi cellulari alla base della progressione della BPCO in risposta all'esposizione al fumo di tabacco.

Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is a heterogeneous lung condition with complex characteristics, while patients with COPD gradually tend to be younger1. Smoking, a primary risk factor for COPD2, has a profound impact on airway epithelial cells, which serve as the initial barrier against tobacco smoke. Despite this known association, the detailed mechanisms through which tobacco smoke induces changes in airway epithelial cells remain inadequately explored. A thorough understanding of these molecular alterations is essential for identifying early diagnostic markers and therapeutic targets for COPD.
To address this gap, we developed a novel in vitro model using murine airway epithelial cells. These cells were subjected to long-term stimulation with cigarette smoke extract (CSE), enabling us to monitor dynamic cellular changes and explore the changes in airway epithelial cells under long-term tobacco stimulation and the underlying mechanism. In this model, transwell was used to provide the air-liquid interface of airway epithelial cells, and cigarette smoke extract was stimulated in the early stage of epithelial cell differentiation until the end of differentiation at 28 days. Previous studies investigated only the differentiation and short-term stimulation of airway epithelial cells (cell line dominance). They were limited to a single regulatory pathway3,4,5,6. However, the protocol presented here uses primary mouse airway epithelial cells and optimizes the cell extraction process for better cell activity than previous airway epithelial cell culture methods. This model focuses on alterations in cellular differentiation alongside comprehensive transcriptomic, proteomic, metabolomic, and epigenomic analyses. Employing immunofluorescence and advanced multi-omics techniques, we aimed to elucidate the cellular responses of airway epithelial cells to chronic tobacco smoke exposure, thereby contributing to a deeper understanding of COPD pathogenesis. This model can be used to explore the changes in airway epithelial cell differentiation pattern and its mechanism caused by long-term stimulation of various pollutants.

Autore in primo piano: Sviluppo e caratterizzazione di un modello in vitro per studiare l'esposizione cronica al fumo di sigaretta e il suo impatto sulle cellule epiteliali delle vie aeree nella ri

Modello in vitro per lo studio del differenziamento e dei cambiamenti di multi-omiche su cellule epiteliali delle vie aeree murine stimolate con estratto di fumo di sigaretta

The scope of our research is to develop and characterize an in vitro model using airway epithelial cells to study the effects of chronic CSC exposure. We aimed to understand the cellular response that occurred in airway epithelial cells under long-term cigarette smoke exposure, which is relevant to the pathogenesis of COPD. The recognition of intricate epithelium immune cell interaction in COPD is considered a pivotal recent development in COPD research.We have established a novel in vitro model that mimic chronic CSC exposure in airway epithelial cells. Our findings open up new avenue of investigating the long-term effect of chronic cigarette smoke exposure on airway epithelial cells and their role in COPD progression. In the future, our laboratory will focus on exploring specific pathway that regulate epithelial cells differentiation and the role of airway epithelial cells heterogenetic in COPD treatment response.

Differenziazione Le cellule epiteliali delle vie aeree murine si sono differenziate con successo dopo la coltura in un'interfaccia aria-liquido con un mezzo di differenziazione per 28 giorni. La presenza di cellule ciliate e caliciformi è stata dimostrata mediante saggio di immunofluorescenza del marcatore ciliale acetilato α-Tubulina (verde; Figura 3A) e il marcatore calicenico Mucin5AC, rispettivamente6 (rosso; Figura 3B).
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Qui, descriviamo un modello in vitro per isolare e differenziare le cellule epiteliali delle vie aeree murine, concentrandosi sulla loro acclimatazione all'estratto di fumo di sigaretta cronico (CSE). Il modello potrebbe essere utilizzato per caratterizzare in modo completo l'impatto multi-omico della CSE, che potrebbe fornire informazioni sulle risposte cellulari in condizioni di esposizione cronica al fumo.

Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is largely attributed to tobacco smoke exposure. Investigating how airway epithelial cells functionally adapt ...

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Research

JoVE Journal

Biology

In Vitro Model for Studying Differentiation and Changes of Multi-Omics on Murine Airway Epithelial Cells Stimulated with Cigarette Smoke Extract

481 Views.  Capital Medical University. Lo scopo della nostra ricerca è quello di sviluppare e caratterizzare un modello in vitro utilizzando cellule epiteliali delle vie aeree per studiare gli effetti dell'esposizione cronica alle CSC. Abbiamo mirato a comprendere la risposta cellulare che si verifica nelle cellule epiteliali delle vie aeree sotto l'esposizione a lungo termine al fumo di sigaretta, che è rilevante per la patogenesi della BPCO. Il riconoscimento dell'intricata interazione tra cel...

Video: Autore in primo piano: Sviluppo e caratterizzazione di un modello in vitro per studiare l'esposizione cronica al fumo di sigaretta e il suo impatto sulle cellule epiteliali delle vie aeree nella ri

Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is largely attributed to tobacco smoke exposure. Investigating how airway epithelial cells functionally adapt to tobacco smoke is crucial for understanding the pathogenesis of COPD. The present study was to set up an in vitro model using primary murine airway epithelial cells to mimic the real-life impact of tobacco smoke. Unlike established cell lines, primary cells retain more in vivo-like properties, including growth patterns, aging, and differentiation. These cells exhibit a sensitive inflammatory response and efficient differentiation, thus closely representing physiological conditions. In this model, primary murine airway epithelial cells were cultured for 28 days under an air-liquid interface with an optimal concentration of cigarette smoke extract (CSE), which led to the transformation of a monolayer of undifferentiated cells into a pseudostratified columnar epithelium, indicative of CSE acclimation. Comprehensive multi-omics analyses were then applied to elucidate the mechanisms by which CSE influences the differentiation of basal airway cells. These insights provide a deeper understanding of the cellular processes underpinning COPD progression in response to tobacco smoke exposure.

Here, we describe an in vitro model for isolating and differentiating murine airway epithelial cells, focusing on their acclimation to chronic cigarette smoke extract (CSE). The model could be utilized to comprehensively characterize the multi-omics impact of CSE, which possibly provides insights into the cellular responses under chronic smoke exposure.

Ricerca

Biologia

Isolation of Primary Murine Airway Epithelial Cells from Murine Tracheas

To begin, arrange freshly prepared expansion medium, filter sterilized proteinase and antibiotic solutions, and sterilized surgical instruments on the working platform of the biosafety cabinet. Add rat tail collagen into 100-millimeter culture dishes and 24-millimeter trans wells. Leave the dishes open overnight under ultraviolet light for sterilization.Immerse the euthanized mouse in 75%ethanol for sterilization. Do not immerse the nose and mouth. Using surgical scissors and forceps, cut and open the epidermis from the lower jaw to the abdominal cavity of the mouse.Using another set of surgical scissors and forceps, tear apart the thyroid glands on both sides and remove the connections between the trachea, the surrounding muscle tissue, and the esophagus. Next, carefully cut into the chest, and use forceps to delve deeper into the chest cavity. Remove the entire lung and find the end of the trachea.Cut out the trachea from the thyroid cartilage to the tracheal bronchial branch, and put it in a pre cold expansion medium containing four antibiotics. Shake the tube to rinse as much blood as possible off the surface of the trachea before placing it on ice. Now transfer the trachea to pre cold PBS containing four antibiotics.Using surgical scissors and forceps, remove clots and other tissue from the surface of the trachea and cut them into one square centimeter size. Incubate tracheal tissue in proteinase solution at 37 degrees Celsius. After 40 minutes, rock the tube several times and use a 40-micron cell strainer to remove the remaining tissues.Rinse the chopped trachea on a strainer with five milliliters of expansion medium. Centrifuge the tracheal suspension at 400 G for five minutes at four degrees Celsius, and resuspend the pellet in eight milliliters of expansion medium. Count the viable cells using trypan blue and the hemocytometer.Plate P0 cell suspension on a 100-millimeter dish, precoated with rat tail collagen. Culture the cells at 37 degrees Celsius with 5%carbon dioxide.

Isolamento di cellule epiteliali primarie delle vie aeree murine da trachee murine

Expansion Culture and Passage of Primary Murine Airway Epithelial Cells

Once the murine tracheal epithelial cells form an intact monolayer with a cobblestone appearance, gently rinse the cells with three milliliters of prewarmed PBS. Add three milliliters of animal component-free enzymatic dissociation solution to the dish and incubate at 37 degrees Celsius for five minutes. Gently pipette to dislodge the cells and transfer the suspension to three milliliters of animal component-free enzyme inhibition solution.Centrifuge the cell suspension at 400 G for five minutes at four degrees Celsius and resuspend the pellet in one milliliter of expansion medium. Count the viable cells using trypan blue and a hemocytometer. Plate P1 cell suspension on a 100 millimeter dish pre-coated with rat tail collagen.Culture the cells at 37 degrees Celsius with 5%carbon dioxide.

Coltura di espansione e passaggio delle cellule epiteliali primarie delle vie aeree murine

Differentiation and Cigarette Smoke Extract (CSE) Stimulation of Primary Murine Airway Epithelial Cells at Air-Liquid Interface

Once the primary murine airway epithelial cells reach 80%confluency, seat cells on a glass slide coated with rat tail collagen. Then, add paraformaldehyde to fix the cells for 12 hours. Wash the slide three times with PBS for five minutes each, and incubate it with 3%bovine serum albumin and 0.1%Triton X-100 in PBS for one hour.Add anti-pan cytokeratin antibody at a dilution of one to 500 onto the slide, and incubate overnight at four degrees Celsius. The next day, wash the slide three times with PBS solution for five minutes each before incubating with secondary antibody at a dilution of one to 1, 000 for two hours in the dark. After washing the slide with PBS, add DAPI at a dilution of one to 1, 000 and incubate for 15 minutes.Wash the slide once with PBS for five minutes. Observe the slide under a fluorescence microscope to compare expression patterns to a positive control and a negative control After detachment and centrifugation, re-suspend the P2 phase cells in an appropriate volume of expansion medium. Pipette one milliliter of cell suspension onto the apical chamber of the Transwell polycarbonate membrane insert.Add 1.5 milliliters of proliferation media to the basal compartment of the Transwell. Incubate the cells at 37 degrees Celsius until confluence is reached. Prepare 50 milliliters of complete differentiation medium using the following components.Bubble one cigarette through 12.5 milliliters of differentiation medium, and then filter it through a 0.22 micron pour filter to prepare cigarette smoke extract or CSE. To ensure standardization between experiments and batches of CSE, measure the absorbance at 320 nanometers on a spectrophotometer. Next, remove the expansion medium from the apical and basal chamber of Transwells.Add a differentiation medium containing an appropriate concentration of CSE to stimulate primary murine airway epithelial cells for 28 days. During incubation, wash the apical chamber twice a week with PBS and replace the medium in the basal chamber with freshly prepared differentiation medium containing CSE. Murine airway epithelial cells successfully differentiated at an air liquid interface in 28 days.The presence of ciliated and goblet cells was demonstrated by immunofluorescence assay of cilia marker, acetylated alpha tubulin, and the goblet cell marker mucin 5AC respectively. Cell viability at 24 hours with varying CSE concentrations demonstrated that epithelial cells declined when the concentration was higher than 6%Cell activity under long-term stimulation showed no significant cell death with 2%4%and 6%CSE concentrations. But changes in transmembrane resistance and exfoliated cells were noted.In addition, an overall reduction in differentiated cells and ciliated cells was noted when murine airway epithelial cell cultures were chronically exposed to CSE.

Differenziazione e stimolazione dell'estratto di fumo di sigaretta (CSE) delle cellule epiteliali primarie delle vie aeree murine all'interfaccia aria-liquido