Per iniziare, procurati una piastra di coltura con le colonie di Methylomonas species LW13. Inoculare le colonie in sei millilitri di sali minerali nitrati in un tubo di vetro. Sigillare la provetta con un tappo per siero e un sigillo a crimpare in alluminio.
Aggiungere metano con una siringa per creare un'atmosfera finale del 50% in volume di metano nell'aria. Agitare questa coltura liquida planctonica a 200 giri al minuto a temperatura ambiente fino a quando non si torbida, il che richiede circa un giorno. Passaggio delle colture liquide in un rapporto di uno a 10 in terreni freschi.
Continuare a far crescere le colture liquide di metanotrofi fino a registrare la crescita della fase, raggiungendo una densità ottica a 600 nanometri di circa 0,5. Per preparare la siringa, rimuovere gli stantuffi in dotazione e metterla in un contenitore sterile. Collegare un puntale sterile del filtro in politetrafluoroetilene o PTFE a ciascuna siringa e posizionare la siringa in un rack per provette standard con la punta rivolta verso il basso.
Quindi, mescolare un millilitro di cellule con cinque millilitri di sali minerali nitrati e quattro millilitri di agarosio fuso in una provetta conica sterile. Versare lentamente la miscela di agarosio nella siringa fino al segno di otto millilitri e lasciarla solidificare. Dopo circa 15 minuti, tappare la siringa con un tappo sterile in gomma butilica da 20 millimetri.
Fissare i tappi con del nastro adesivo da laboratorio ed etichettare la siringa. Successivamente, riempire una grande siringa da 60 millilitri con metano al 100% e collegare una punta del filtro in PTFE collegata a un ago sterile calibro 23. Forare il tappo di gomma della siringa con la miscela di agarosio con una siringa grande e inserire un secondo ago sterile come uscita del gas.
Premere lo stantuffo della siringa grande per consentire a 20 millilitri di metano al 100% di fluire attraverso lo spazio della testa. Rimuovere l'ago di uscita quando sono rimasti uno o due millilitri di metano nella siringa per evitare il riflusso di ossigeno. Incubare la siringa con una miscela di agarosio e metano a 18 gradi Celsius.
Per estrudere l'agarosio, sostituire la punta del filtro in PTFE con un ago sterile calibro 23 e il tappo in gomma con lo stantuffo della siringa in dotazione. Premere lentamente lo stantuffo per erogare incrementi di un millilitro in provette sterili separate da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Il ceppo wild type LW13 formava una banda orizzontale distinta a una profondità specifica nella siringa a gradiente dove sia le concentrazioni di metano che di ossigeno erano basse.
LW13 inoculato in siringhe a gradiente ha mostrato un controgradiente metano-ossigeno con deplezione di metano e consumo di ossigeno corrispondenti alla profondità della banda orizzontale. Il mutante di delezione OAT di LW13 mancava della distinta formazione di bande orizzontali osservata nel ceppo wild type, indicando il ruolo del gene in questo fenotipo.
