Per iniziare, inserisci la coda del mouse nell'apertura superiore del tubo di contenzione. Tirare lentamente il mouse nel tubo e posizionare la spina davanti al mouse per evitare che fuoriesca. Per realizzare un manicotto di contenimento per un topo più piccolo, taglia l'estremità del naso del cono per assicurarti che il naso del topo non sia ostruito e abbia abbastanza spazio per respirare.
Quindi taglia la parte posteriore del cono in modo simile alla lunghezza del topo. Posizionare il mouse nel fermatubo come descritto in precedenza. Tenendo la coda del topo, lascia che il topo entri nel cono.
Far scorrere il cono di ritenuta nel tubo. Assicurati che la coda del topo sia completamente fuori dalla parte posteriore del tubo e che il topo abbia spazio per respirare all'interno del cono. Fissare il tappo del tubo immediatamente davanti all'apertura del naso del cono.
Riempi il tubo conico da 15 millilitri con acqua tiepida. Posizionare il fermatubo con il mouse al suo interno sulla piattaforma rialzata. Immergi la coda del topo trattenuta in acqua tiepida per almeno un minuto fino a quando le vene laterali non sono chiaramente dilatate e visibili.
Posizionare il virus adeno-associato senza tappo, o AAV, contenente una provetta per microcentrifuga da 1,7 millilitri nel rack per provette. Con la mano dominante, inserire l'ago verticalmente nel tubo. Una volta che l'ago è all'interno del tubo, tenere il tubo con la mano non dominante.
Quindi sollevare contemporaneamente il tubo e la siringa all'altezza degli occhi, assicurandosi che l'ago non tocchi la parete del tubo. Appoggiare entrambe le braccia sul tavolo e tirare lentamente la dose nella siringa. Espellere le bolle d'aria dalla siringa su un tampone assorbente monouso.
Tenere premuto l'iniettore per 40 secondi per riscaldarlo. Dopo esserti assicurato che le vene della coda siano chiaramente visibili, rimuovi il sistema di ritenuta del tubo dalla piattaforma rialzata e posizionalo direttamente sul tavolo. Posizionare il mouse nel sistema di ritenuta con i piedi rivolti verso il basso per maneggiare facilmente la coda.
Pulisci rapidamente la coda con una garza per asciugarla. Quindi pulire la coda con un tampone imbevuto di alcol e asciugarla nuovamente con una garza asciutta. Ruotare la coda di circa 90 gradi a sinistra o a destra in modo che una delle due vene laterali sia rivolta verso l'alto.
Individuare un sito di iniezione adatto all'interno del terzo medio della coda. Tenere la coda con la mano non dominante usando il pollice e l'indice immediatamente distalmente al sito di iniezione. Pieghi la coda sopra il dito indice in modo che il sito di iniezione sia piatto sul dito indice.
Quindi tirare indietro la coda per allungarla e il sito di iniezione è completamente orizzontale. Tenere la siringa utilizzando l'indice e il medio della mano dominante su entrambi i lati della flangia del cilindro della siringa, tenendo il pollice pronto allo stantuffo. Appoggiare entrambe le mani sul tavolo e posizionare l'ago direttamente sopra e parallelamente alla coda e alla vena con lo smusso rivolto verso l'alto.
Ora applica una pressione verso il basso sull'ago e fallo scorrere in avanti nella vena per iniettare la soluzione AAV nella vena. Dopo aver somministrato la dose, estrarre lentamente l'ago e applicare immediatamente una pressione con una garza nel sito di iniezione per almeno 10 secondi fino a quando l'emorragia non si ferma. L'imaging istologico della proteina reporter fluorescente dopo l'iniezione ha mostrato che tdTomato era espresso diffusamente in tutto il fegato e nel quadricipite, indicando che AAV9 raggiungeva e trasduceva ampiamente diverse regioni di entrambi i tessuti.
