Per iniziare, eseguire la reazione a catena della polimerasi, o PCR, per amplificare la regione desiderata del DNA estratto dal tessuto. Portare la master mix di enzimi di amplificazione del sequenziamento, il tampone e l'acqua distillata a doppia distillazione a temperatura ambiente e avviare immediatamente. Dopo aver preparato le provette per il sequenziamento, posizionare la provetta per PCR sullo strumento PCR preimpostato per l'amplificazione.
Quindi rimuovere il prodotto dallo strumento PCR e conservare i prodotti di reazione in frigorifero, al riparo dalla luce. Agitare accuratamente le perline magnetiche. Aggiungere 10 microlitri di microsfere magnetiche e 40 microlitri di etanolo all'80% alla piastra a 96 pozzetti e sigillare la piastra con una pellicola.
Posizionare la piastra a 96 pozzetti su un agitatore a vortice per 10 secondi per sospendere e mescolare completamente le perline. Quindi fissare la piastra con un elastico su un oscillatore orizzontale e vibrare al massimo per tre-cinque minuti. Quindi, posizionare la piastra PCR su un supporto magnetico, assicurandosi che sia premuta saldamente.
Mantenere il supporto a quattro gradi Celsius per tre minuti per l'adsorbimento statico. Una volta che le perline sono state adsorbite, rimuovere la pellicola del soffitto e versare il liquido di scarto. Sciacquare le perle due volte con 40 microlitri di etanolo all'80%.
Dopo aver versato il liquido di scarto, posizionare il piatto su carta assorbente e asciugarlo delicatamente. Mettere la carta assorbente con la piastra magnetica in una centrifuga e centrifugare brevemente a 120 g. Dopo aver tolto l'alcol, metti la piastra in forno a 60 gradi Celsius per tre o cinque minuti per asciugare completamente le perline.
Quindi, aggiungi 40 microlitri di acqua pura al piatto e sigillalo con una pellicola. Agitarlo su uno shaker a vortice per tre-cinque secondi e posizionare la piastra su uno shaker orizzontale. Fissarlo e lasciare agitare la piastra per tre-cinque minuti per sciogliere il prodotto di sequenziamento purificato.
Infine, centrifugare il prodotto di sequenziamento disciolto a 180 g e utilizzare il prodotto per l'analisi genomica mediante elettroforesi capillare. Questo metodo potrebbe rilevare la mutazione nota RHOA G17V e altre mutazioni a bassa frequenza nell'intervallo di amplificazione dei primer a monte e a valle. Anche le mutazioni in due geni aggiuntivi, vale a dire IDH2 e JAK1, sono state analizzate correttamente con questo metodo.
