Per iniziare, metti sul ghiaccio il collagene, l'idrossido di sodio, l'acqua ultrapura sterile, 10 volte il PBS, una provetta per microcentrifuga, l'acido ialuronico metacrilato e il fotoiniziatore. Quindi posizionare gli inserti di coltura tissutale nella piastra ed etichettarla. Per preparare una soluzione di collagene da tre milligrammi per millilitro, combinare collagene ad alta concentrazione, un normale idrossido di sodio, acqua ultrapura e 10 volte PBS.
Aggiungere i componenti alla provetta della microcentrifuga e tenere il puntale della pipetta immerso durante la miscelazione per evitare la formazione di bolle. Successivamente, centrifugare le celle a 200 G per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi rimuovere delicatamente il terreno in eccesso dalla parte superiore di ciascuna soluzione per la condizione cellulare, lasciando il volume di terreno necessario per la condizione.
Metti queste soluzioni sul ghiaccio. Aggiungere il volume calcolato di soluzione di collagene a ciascuna soluzione per la condizione cellulare. Quindi, aggiungere il volume calcolato di acido ialuronico metacrilato all'1%, seguito da 17 milligrammi per millilitro LAP in ciascuna soluzione di condizione cellulare.
Mescolare ogni provetta per le condizioni una alla volta mantenendo il puntale della pipetta immerso per evitare la formazione di bolle e aggiungere da 100 a 150 microlitri a ciascun inserto di coltura tissutale. Ora accendi la lampada ultravioletta a 385 nanometri a corrente costante. Per fotografare ogni gel, esporre ogni pozzetto alla luce ultravioletta per 45 secondi, uno alla volta.
Quindi posizionare la piastra a 37 gradi Celsius per 30-45 minuti per reticolare il collagene. Utilizzando un terreno basale astrale con 0,5% e due volumi in volume e 1% in volume di B27 senza vitamina A, applicare la testina di pressione del fluido sui gel. Aggiungere i terreni alla piastra a pozzetti e agli inserti di coltura tissutale per un flusso netto pari a zero.
Posizionare la piastra a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica per almeno 18 ore o fino a cinque giorni.
