Per iniziare, mantenere HEK293T cellule in terreni di coltura contenenti DMEM con il 10% di FBS in un incubatore umidificato. Controllare la confluenza della piastra al microscopio. Quando le cellule raggiungono circa l'80-90% di confluenza, rimuovere il terreno e lavarle con 10 millilitri di DPBS.
Quindi, rimuovere il DPBS dal piatto di coltura. Trattare le cellule con un millilitro di rosso fenolo 0,05% tripsina-EDTA e incubare le cellule per tre minuti a 37 gradi Celsius. Dopo aver rimosso la piastra dall'incubatore, aggiungere nove millilitri di terreno di coltura per arrestare la reazione della tripsina e mescolare pipettando per rimuovere le cellule rimanenti.
Ora, trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 50 millilitri. Centrifugare a 300g per cinque minuti a temperatura ambiente. Una volta rimosso il terreno, risospendere i pellet di cella in un millilitro di terreno fresco.
Per piastrare le cellule in una piastra a sei pozzetti, combinare il volume necessario di cellule con 13 millilitri di terreno in una provetta da 50 millilitri. Quindi, erogare due millilitri di sospensione cellulare diluita in ciascuno dei sei pozzetti e picchiettare delicatamente la piastra su tutti i lati per distribuire le cellule in modo uniforme. Successivamente, posizionare la piastra in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per una notte.
