Per iniziare, il seme ha diviso le nostre cellule T HEK293 trasfettate ad anello in una piastra a 96 pozzetti rivestita di poli-D-lisina. Successivamente, preparare tre soluzioni fresche di Rhosin, Ehop-016 e ZCL278 in un Microfuge II da 1,7 millilitri.Aggiungere il substrato di cellule vive per la luciferasi renilla, diluito da 1 a 2.000, a una concentrazione finale di 30 millimolari per ciascuna soluzione. Per realizzare soluzioni ZCL278 0,55 e 50 micromolari, eseguire diluizioni seriali utilizzando i 50 micromolari iniziali di ZCL278 in terreni di coltura.
Quindi rimuovere il terreno da ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti contenente le cellule trasfettate. Aggiungere 50 microlitri della miscela di prodotti chimici e substrati in ciascun pozzetto. Dopo aver incubato le cellule per un'ora, due ore o cinque ore, caricare la piastra sul lettore di piastre di luminescenza e misurare la luminescenza.
Assicurarsi che il lettore di piastre sia acceso prima di iniziare. Accedi al software per la lettura di micropiastre e fai clic su nuova sessione per creare un nuovo file. Fare clic sull'incubatrice per impostare la temperatura del lettore di piastre a 37 gradi Celsius.
Controlla l'opzione di temperatura e digita 37 gradi Celsius. In Layout piastra, scegli l'opzione sconosciuto e fai clic e trascina il pozzetto per specificare i pozzetti da misurare. Quindi vai su protocollo, fai clic su luminescenza e mantieni le impostazioni predefinite.
Una volta completata la configurazione, caricare la piastra con il coperchio nel lettore di piastre e scegliere Esegui piastra dentro. Fai clic su Avvia e apparirà una finestra di salvataggio del file. Rinomina il file e fai clic su Salva.
Una volta completata la lettura, rimuovere la piastra dal lettore di lastre, quindi fare clic sull'opzione di esecuzione della piastra per reinserire il lettore. Una volta completata, riposizionare la piastra nell'incubatrice umidificata fino alla lettura successiva. A una, due e cinque ore di trattamento, le cellule trattate con Rhosin non hanno mostrato cambiamenti significativi nell'attività della luciferasi rispetto alle cellule trattate con DMSO di controllo.
L'inibitore della GTPasi Rac EHop-016 ha mostrato un'attività della luciferasi significativamente inferiore rispetto al DMSO. Le cellule trattate con ZCL278 avevano un'attività della luciferasi significativamente più bassa rispetto al DMSO di controllo in tutti e tre i punti temporali. Le attività della luciferasi misurate a una, due e cinque ore dopo il trattamento hanno mostrato una risposta dose-dipendente.
Concentrazioni più elevate di ZCL278 hanno comunque mostrato cambiamenti significativi rispetto al DMSO di controllo.
