Per iniziare, ottenere cellule HEK 293T e piastra 800.000 cellule per pozzetto in una piastra di coltura tissutale a 6 pozzetti in terreni DMEM integrati. Incubare la piastra per una notte a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per ottenere una confluenza dal 60 all'80%. Successivamente, mescola un microgrammo di ciascun DNA plasmidico con 200 microlitri di DMEM privo di siero e sei microlitri di reagente di trasfezione.
Dopo 15 minuti di incubazione, erogare 100 microlitri di miscela di trasfezione per pozzetto di cellule. Incubare per una notte in un incubatore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Il terzo giorno, aggiungere una quantità appropriata di rapamicina o etanolo separatamente alle cellule e incubarle per un'ora in un incubatore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.
Quindi posizionare la piastra sul ghiaccio e lavare delicatamente le celle con tre millilitri di PBS freddo. Dopo aver rimosso il PBS, aggiungere 300 microlitri di tampone di lisi contenente rapamicina o etanolo e raschiare le cellule con un raschietto cellulare. Trasferire il campione in una provetta da 1,5 millilitri e microcentrifugarlo per 10 minuti a 1.000 g a quattro gradi Celsius.
Per verificare i livelli di espressione, aliquotare 20 microlitri di surnatante in un nuovo tubo da 1,5 millilitri. Incubare il campione con 20 microlitri di tampone Laemmli 2x contenente il 5% di beta mercaptoetanolo a una temperatura compresa tra 95 e 100 gradi Celsius per cinque minuti.
