Per iniziare la trasformazione delle cellule BL21 DE3 di Escherichia coli, scongelare 50 microlitri di aliquota di sospensione cellulare competente su ghiaccio. Aggiungere un microlitro di DNA del plasmide pET 28a Sumo TRF2 alla sospensione cellulare competente e agitare delicatamente la provetta per mescolare la sospensione. Dopo la trasformazione, distribuire 100 microlitri di sospensione cellulare su una piastra di agar luria bertani, o LB, contenente 50 microgrammi per millilitro di kanamicina.
Incubare le cellule per una notte a 37 gradi Celsius. Il giorno successivo, raccogliete una colonia di cellule trasformate e coltivatela in cinque millilitri di terreno LB, integrati con 50 microgrammi per millilitro di kanamicina. Incubare per 18 ore a 37 gradi Celsius, agitando a 220 giri/min.
Dopo l'incubazione, indurre la coltura con un millimolare di IPTG come concentrazione finale. Incubare a 20 gradi Celsius per 17 ore per promuovere l'espressione proteica. Caricare gli estratti di proteina grezza, insieme al tampone di caricamento, su un gel SDS-PAGE.
Eseguire i campioni inizialmente a 100 volt per 30 minuti, seguiti da 120 volt per 50 minuti in un tampone di tris-glicina. Quindi, colorare con il blu Coomassie per visualizzare l'espressione proteica. Per la purificazione delle proteine, centrifugare l'estratto di proteina grezza a 38.000 g per 40 minuti a quattro gradi Celsius e filtrare il surnatante attraverso un filtro a siringa da 0,22 micrometri.
Caricare il surnatante filtrato sulla colonna di nichel pre-equilibrata nel tampone legante. Lavare la colonna con il tampone legante ed eluire la proteina con il gradiente di imidazolo preparato, raccogliendo 12 frazioni di un millilitro ciascuna. Aggiungere glicerolo a una concentrazione finale del 50% alla proteina concentrata e tampone scambiata per la conservazione.
L'espressione di TRF2 in Escherichia coli è stata dimostrata con successo, come mostrato da SDS-PAGE, dove bande distinte corrispondenti a TRF2 sono apparse prima e dopo l'induzione.
