Per iniziare, centrifugare una volta 10 alla potenza di sette linee cellulari HeLa contenenti frammenti di restrizione telomerica DNA a 1.000 g per tre minuti. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 200 microlitri di PBS. Dopo il trattamento con SDS proteinasi K e cloruro di sodio, centrifugare la sospensione cellulare a 16, 900 g per 10 minuti.
Trasferire il surnatante in una nuova provetta da centrifuga e aggiungere un volume uguale di isopropanolo, evitando la formazione di lipidi o sedimenti galleggianti. Centrifugare ad alta velocità e lavare il pellet con 500 microlitri di etanolo al 70%. Dopo aver essiccato il pellet di DNA, risospenderlo con cura in 475 microlitri di tampone TE e mescolare delicatamente picchiettando il fondo della provetta.
Ora, aggiungi 25 microlitri di 10 milligrammi per millilitro di RNAsay e picchietta il tubo fino a quando il pellet non è completamente sciolto. Quindi, aggiungere 1/10 di volume di acetato di sodio a tre molari e due volumi di etanolo freddo al 100% e posizionare il tubo a meno 80 gradi Celsius per due o tre ore. Dopo la centrifugazione e i lavaggi con etanolo al 70%, aggiungere 100 microlitri di tampone TE al pellet di DNA, picchiettare la provetta per mescolare e posizionarla a quattro gradi Celsius per due ore per scioglierla completamente.
Per la digestione del DNA, combinare quattro microgrammi di DNA genomico con un microlitro di CviAII, due microlitri di tampone di digestione 10X e acqua per raggiungere un volume totale di 20 microlitri. Incubare la miscela a 25 gradi Celsius per 12 ore. In un termociclatore, riscaldare la miscela a 75 gradi Celsius per tre minuti.
Quindi, diminuire la temperatura di 0,1 gradi Celsius ogni 30 secondi fino a raggiungere i 25 gradi Celsius. Dopo la pulizia e l'asciugatura, rivestire i vetrini del coperchio inferiore con 20 microlitri di nitrocellulosa allo 0,1% e aggiungere perline di riferimento. Cuocere i vetrini coprioggetto a 100 gradi Celsius per quattro minuti.
Assemblare il sandwich della cella di flusso. E dopo il riscaldamento a 85 gradi Celsius, utilizzare due tamponi per massaggiare il gruppo fino a quando il Parafilm non sigilla il canale. Lavare 10 microlitri di perline M-270 cinque volte con 50 microlitri di tampone di lavoro utilizzando un magnete.
Dopo il lavaggio, aggiungere le perle sopra il DNA genomico digerito in una provetta da centrifuga da 1,5 millilitri. Agitare delicatamente il tubo alcune volte per mescolare le perle e il campione di DNA. Lasciare il composto in ghiaccio per un'ora.
Dopo l'incubazione, lavare la miscela con 500 microlitri di tampone di lavoro tre volte utilizzando un magnete per tirare le perle verso il basso con intervalli di 10 minuti tra un lavaggio e l'altro. Risospendere il campione in un tampone di lavoro e caricare 30 microlitri della miscela nella cella di flusso. Sciacquare le perle magnetiche non legate dopo 30 minuti.
Dopo aver posizionato la cella di flusso sopra la lente dell'obiettivo, selezionare una coppia di magneti cubici da cinque millimetri disposti in una configurazione verticale e allineare il supporto del magnete con l'asse x del percorso luminoso delle pinzette magnetiche per l'imaging. Avvia il software di programmazione grafica e collega i controller per le pinzette magnetiche. Regolare il campo visivo per individuare un cordone di riferimento nella parte inferiore della cella di flusso e regolare leggermente la lente dell'obiettivo in modo che il cordone di riferimento mostri anelli di defrazione chiari.
Scrivi uno script in MATLAB per controllare i movimenti motori per i saggi di rampa di forza. Importa lo script in un software di programmazione grafica per testare gli esperimenti su una singola molecola. A una velocità di flusso lenta, caricare 200 microlitri di TRF1 a 10 nanomolari nella cella di flusso.
Dopo 30 minuti di associazione, scegliere uno script per un esperimento di rampa di forza con una velocità di caricamento della forza di più/meno un piconewton al secondo. Assegna un nome ai file di dati ed esegui l'esperimento. L'integrità del DNA genomico è stata confermata utilizzando l'elettroforesi su gel di agarosio, con il TRS risultante che mostra lunghezze coerenti su varie linee cellulari umane.
Le sequenze di ripetizione telomerica in TRS sono state rilevate tramite southern blotting, mostrando chiari segnali di ibridazione. Le curve di estensione della forza dal saggio della rampa di forza hanno mostrato modelli a zigzag durante l'allungamento, indicando la rottura delle interazioni proteina DNA. La cinetica di dissociazione dei complessi proteici del DNA telomerico ha mostrato una relazione lineare tra forza e velocità di dissociazione.
Inoltre, l'eterogeneità della lunghezza del DNA telomerico proveniente da cellule umane studia il meccanismo di formazione dell'ansa in telomeri di varie lunghezze.
