Per iniziare, scongelare le cellule epiteliali della superficie ovarica umana crioconservate. Mescolare le celle con 10 millilitri di terreno di lavaggio. Dopo aver centrifugato le cellule, risospendere il pellet in due millilitri di epitelio superficiale ovarico o terreno OSE 2D e trasferirlo in due pozzetti di una piastra a 12 pozzetti.
Aggiungere un millilitro di terreno OSE 2D extra nel pozzetto e coltivare a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato con il 5% di anidride carbonica per 72 ore prima del primo rinnovo del terreno. Utilizzare la colorazione Trypan Blue per contare le cellule epiteliali della superficie ovarica umana viva appena isolate o crioconservate con un contatore di cellule automatizzato. Mescolare il numero desiderato di cellule in un millilitro di terreno base di organoide OSE ghiacciato e centrifugare la provetta a 240 G per cinque minuti.
Utilizzando una pipetta, risospendere il pellet cellulare in una soluzione di estratto di membrana basale ghiacciata e non diluita per ottenere 10.000 cellule per 10 microlitri. Aggiungere 10 microlitri di soluzione di estratto della membrana basale OSE per pozzetto in un vetrino a camera multipozzetto preriscaldato e posizionare la piastra capovolta a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato con il 5% di anidride carbonica per 15 minuti. Dopo che il gel si è solidificato, aggiungere 100 microlitri di terreno OSE 3D e coltivare a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato con il 5% di anidride carbonica.
Dopo aver rimosso il terreno esaurito, aggiungere 100 microlitri di DMEM F12 avanzato ghiacciato a ciascun pozzetto. Raschiare il fondo dei pozzetti con un puntale per pipetta P1000 per staccare le goccioline di gel e trasferire ogni goccia di gel galleggiante in una provetta da 1,5 millilitri. Centrifugare la provetta a 240 g per cinque minuti.
Dopo aver scartato il surnatante, risospendere il pellet in 300 microlitri di tampone di dissociazione cellulare e posizionare le provette in un bagno di perle preriscaldate a 37 gradi Celsius per 5-10 minuti. Quindi, aggiungere 300 microlitri di terreno basico di organoide umano OSE e centrifugare a 240 G per cinque minuti. Infine, risospendere il pellet nel volume desiderato di soluzione di estratto di membrana basale non diluita per riseminarli in un rapporto adatto alla coltura.
Le cellule OSE umane primarie hanno mostrato una morfologia simile a quella di un ciottolo fino al passaggio tre, ma hanno mostrato segni di senescenza in seguito. Gli organoidi OSE umani provenienti da cellule OSE appena isolate sono cresciuti più di quelli provenienti da cellule OSE espanse 2D dopo 14 giorni di coltura. Negli organoidi 3D OSE sono state osservate varie morfologie, tra cui cluster cellulari cistici, monostrato, multistrato e non lumizzati.
