Per iniziare, disporre il tampone di blocco sterilizzato con filtro appena preparato, il tampone di reazione 10X uno e due su una piattaforma di lavoro. Mettere le provette aperte contenenti 2,5 millilitri di tampone bloccante e cinque millilitri di acqua ultrapura in un essiccatore e degassare sotto vuoto. Dopo 15 minuti, rilasciare la pressione e rimuovere i tubi.
Posizionare il gruppo di celle a flusso biotina-PEG preparato su un tavolino da microscopio e fissarlo con stucco adesivo a ciascuna estremità. Collegare il tubo di uscita della cella di flusso alla pompa a siringa tramite l'ago. Accendere il riscaldatore dell'obiettivo a 30 gradi Celsius.
Fissare uno o due millilitri di acqua degassata in un tubo su un pezzo separato di stucco adesivo vicino alla cella di flusso. Inserire il tubo di ingresso nel tubo fino a raggiungere il fondo e far scorrere l'acqua attraverso il canale. Aumentare la portata per rimuovere eventuali bolle intrappolate vicino al tubo di ingresso.
Aggiungere 100 microlitri di tampone bloccante degassato a un'aliquota da 20 microlitri di un milligrammo per millilitro di streptavidina. Fissare il tubo aperto allo stucco adesivo. Trasferire il tubo di ingresso dall'acqua alla streptavidina e avviare il flusso a una velocità di 40 microlitri al minuto per due minuti.
Dopo cinque minuti, lavare via la streptavidina in eccesso con il tampone bloccante. Flusso in DNA biotinilato diluito in tampone bloccante contenente 25 nanomolari SYTOX Orange. Immagine utilizzando la visualizzazione dal vivo con il laser a 532 nanometri per osservare il DNA che si lega alla superficie in tempo reale.
Una volta raggiunta la densità desiderata di DNA sulla superficie, far fluire in un tampone bloccante contenente 25 nanomolari SYTOX per eliminare il DNA libero. Ora, flusso e anticorpo anti-digossigenina biotinilato diluito in tampone bloccante contenente 25 nanomolari SYTOX Orange. Lavare via l'anticorpo biotinilato anti-digossigenina e SYTOX Orange con tampone bloccante.
Versare 50 microlitri di miscela di ATP-gamma-S nella cella di flusso. Aggiungere l'elicasi CMG purificata a circa 100 concentrazioni finali nanomolari in 30 microlitri di miscela ATP-gamma-S e fluire a 20 microlitri al minuto per 20 microlitri. Incubare per 15 minuti.
Successivamente, far fluire nella miscela ATP RPA a 40 microlitri al minuto per 80 microlitri. Utilizzando ciascun laser con un'esposizione da 50 a 100 millisecondi, visualizzare e acquisire EGFP RPA con un laser a 488 nanometri, quindi acquisire CMG con un laser a 640 nanometri. Infine, visualizza e acquisisci il DNA colorato con SYTOX Orange con un laser a 532 nanometri.
Lo svolgimento del DNA dell'elicasi del CMG è stato visualizzato dalla crescita lineare dell'RPA giallo tracciato nel tempo, indicando i filamenti di DNA svolti. Il danno al DNA a singolo filamento ha ridotto il numero di eventi di svolgimento riusciti osservati, come dimostrato da un minor numero di tracce complete nei dati.
