Per iniziare, aggiungere un volume della camera di proteina miosina-7a umana purificata in tampone di motilità di cloruro di sodio da 500 millimolari alla camera di flusso e incubarla per cinque minuti a temperatura ambiente. Lavare la camera di flusso con tre volumi di camera di un milligrammo per millilitro BSA in tampone di motilità di cloruro di sodio da 150 millimolari. Successivamente, aspirare il liquido utilizzando un panno pulito all'uscita per assorbire il liquido in eccesso.
Quindi, far fluire un volume della camera di 10 nanomolari di F-actina marcata con rodamina e falloidina in un tampone di motilità di cloruro di sodio da 150 millimolari attraverso la camera di flusso. Monitora il legame dei filamenti di actina alla superficie con un microscopio a fluorescenza con un obiettivo 100x. Garantire una densità ottimale del filamento di actina per il tracciamento, con filamenti sufficienti nel campo visivo ma abbastanza radi da evitare sovrapposizioni.
Successivamente, lavare la camera di flusso con tre volumi di camera di tampone di motilità di cloruro di sodio da 150 millimolari per rimuovere i filamenti di actina non legati e l'eccesso di rodamina-falloidina. Per avviare la motilità, aggiungere un volume della camera del tampone finale alla camera di flusso. Quindi, registra le immagini su un microscopio a fluorescenza utilizzando l'eccitazione a 561 nanometri per visualizzare l'actina marcata con rodamina e falloidina.
Trova un'area del vetrino con la densità di actina desiderata e acquisisci immagini ogni 30 secondi per 30 minuti. Successivamente, scarica e installa il programma Fast dal repository GitHub. Assicurati che sia la versione compatibile con Python 3 con un modulo aggiuntivo per la conversione di file ND2.
Eseguire il programma Fast utilizzando un valore di tolleranza di 33 per trattenere solo i filamenti che si muovono in modo fluido. Successivamente, utilizzare il programma Fast per analizzare le immagini TIFF appena create. Impostare il valore massimo x su 20.000 nanometri e il valore massimo y su 20 nanometri al secondo per rappresentare la lunghezza massima del filamento e la velocità massima del filamento.
Quindi, utilizzare px per impostare la dimensione dei pixel dell'immagine acquisita a 65 nanometri. Impostare minV a 0,1 nanometri al secondo come velocità minima richiesta per l'inclusione del filamento nell'analisi. Per impostare la distanza massima consentita tra i fotogrammi per i filamenti da collegare, utilizzare maxD, evitando il collegamento di filamenti separati tra i fotogrammi.
Utilizzare pt per impostare la tolleranza per le fluttuazioni della velocità del filamento, includendo solo quei filamenti con movimenti fluidi. Infine, utilizzare d per indicare la cartella contenente gli stack TIFF per l'analisi. Il test di scorrimento del filamento di actina ha dimostrato la lenta motilità della miosina-7a, con la riproduzione video accelerata di 500 volte per visualizzare il movimento.
La distribuzione della velocità della miosina-7a ha mostrato un picco inferiore a cinque nanometri al secondo, confermando la sua lenta motilità.
