Per iniziare, lava i semi di Pinus pinaster certificati in acqua corrente del rubinetto per rimuovere i detriti più grandi. Quindi lavare i detriti più fini utilizzando una comune soluzione detergente con energica agitazione. In una cappa a flusso, aggiungere una soluzione di candeggina commerciale fino a coprire i semi e mescolare energicamente per 15 minuti.
Dopo aver scartato la soluzione di candeggina, sciacquare i semi tre volte con acqua di rubinetto sterilizzata. Ora immergi i semi in etanolo all'80% per 15 minuti agitando vigorosamente. Dopo aver smaltito l'etanolo, lavare i semi tre volte con acqua ultrapura sterilizzata.
Per la germinazione del pino, rompere i rivestimenti dei semi sterilizzati con un tornio meccanico sterile. Isolare i pinoli e metterli in un contenitore chiuso con carta da filtro bagnata sterilizzata per idratarli durante la notte. Il giorno successivo, stratificare i pinoli idrati a quattro gradi Celsius per sette giorni per interrompere la dormienza e sincronizzare la germinazione.
Quindi mantenere i pinoli al buio a 25 gradi Celsius fino alla germinazione. Trasferisci i pini germinati asettici in condizioni ambientali controllate per due settimane, o fino a quando il fusto principale inizia a svilupparsi. Dopo due settimane, taglia la parte aerea della piantina sopra la radice con un bisturi e trasferiscila in un terreno di coltura Schenk Hildebrandt sterilizzato.
Mantenere la coltura in condizioni ambientali controllate come descritto in precedenza. Sottocoltura periodicamente tagliando il tessuto calloso alla base del germoglio con un bisturi sterile. Trasferire il grappolo di germogli utilizzando una pinzetta sterile in un terreno di coltura di moltiplicazione fresco.
Successivamente, inoculare i microgermogli nel terreno di coltura Schenk Hildebrandt contenente tre grammi per litro di carbone attivo per l'allungamento del microstelo. Posizionare ora i germogli allungati nel terreno di coltura Schenk Hildebrandt senza fitormoni o carbone attivo. Aggiungi da 100 a 150 nematodi di pino sterilizzati in fase di vita mista nella parte inferiore del microgermoglio.
Mantenere la coltura in condizioni ambientali controllate come descritto in precedenza. L'insediamento e l'infezione dei germogli di pino in vitro hanno mostrato la comparsa di aghi clorotici entro un mese dalla co-coltura con i nematodi del legno di pino.
