Per iniziare, metti le immagini sane e degenerate dell'occhio di mosca della Drosophila nella stessa cartella. Assicurati che i file siano denominati in modo appropriato per identificare i gruppi sperimentali e distinguere tra maschi e femmine. Apri il software Ilastik.
Fare clic su Crea nuovo progetto. Quindi, da Altri flussi di lavoro, selezionare Conteggio densità celle e selezionare una posizione in cui salvare il file di progetto. In sequenza, fare clic su 1.
Inserisci dati, Aggiungi nuovo e Aggiungi immagini separate per scegliere l'immagine standard. Quindi fare clic su 2. Selezione delle funzioni e selezionare le funzioni.
Scegli più valori sigma per aumentare la sensibilità. Fare clic su 3. Conteggio e impostare il valore sigma in primo piano su 5.00.
Utilizzando lo strumento in primo piano, contrassegnare 50 o più ommatidi individuali sull'immagine standard. Fare clic su 3. Contando di nuovo e utilizzando lo strumento sfondo per contrassegnare l'area al di fuori degli ommatidi.
Disegna linee verdi a forma di reticolo attorno agli ommatidi. Fare clic su 4. Esporta densità e scegli Esporta impostazioni immagine per regolare le impostazioni dell'immagine.
Quindi fare clic su Informazioni file di output e selezionare il formato tiff per ulteriori analisi in Flynotyper. Fare clic su 5. Elaborazione batch, selezionare i file di dati grezzi e selezionare tutte le foto sperimentali delle mosche da analizzare.
L'elenco delle immagini importate da analizzare viene visualizzato in Seleziona file di dati grezzi. Fare clic su Elabora tutti i file nella parte inferiore del 5. Sezione Elaborazione batch.
Dopo che il software ha completato l'elaborazione, controllare la cartella contenente le immagini sperimentali dell'occhio di mosca. Verifica che siano presenti immagini nere denominate, ovvero le probabilità del nome del campione. In ImageJ, aprire il file tiff generato da Ilastik.
Usa lo strumento di selezione del rettangolo per creare un rettangolo attorno all'occhio. Seleziona Ctrl X o Ctrl C per ritagliare l'area e attendi che appaia una casella nera a forma di contorno del rettangolo. In sequenza, fare clic su File, Nuovo e Appunti interni per aprire l'occhio di mosca ritagliato.
Per salvare l'occhio di mosca tagliato come JPEG, fare clic su File, Salva con nome e JPEG. In ImageJ, fare clic su Plugin e Flynotyper. In Genotipi, seleziona Aggiungi genotipi e apri la cartella contenente le immagini dell'occhio di mosca tagliata.
Seleziona le caselle Microscopio ottico e Verticalmente. Quindi, in Classifica Ommatidia per, seleziona le caselle Stabilità e Distanza dal centro. Per il numero di ommatidi classificati considerati, impostare l'input su 200.
Fare clic su Esegui e attendere che vengano visualizzati i risultati dell'analisi. Copia e incolla il file di esempio e il P-score nel software statistico per ulteriori analisi. Le immagini degli occhi di Drosophila elaborate con Ilastik e analizzate sotto luce anulare hanno mostrato pattern ommatidiali più chiari rispetto a quelle senza luce anulare, migliorando la valutazione qualitativa.
L'analisi di Flynotyper ha indicato punteggi fenotipici significativamente più elevati negli occhi di mosca moderatamente e gravemente degenerati rispetto agli occhi non degenerati. Quando Ilastik non è stato utilizzato, i punteggi P tra gli occhi non degenerati e moderatamente degenerati erano simili.
