Per iniziare, prendi i neuroni cresciuti in fiasche T25 per la co-coltura. Sostituire il terreno con cinque millilitri di soluzione di versene contenente tripsina e Dnasi I.Aggiungere 0,5 millilitri di siero fetale bovino per neutralizzare la tripsina e la Dnasi I.Trasferire le cellule in una provetta conica da 15 millilitri. Lavare il matraccio con cinque millilitri di terreno neurobasale completo una volta per massimizzare i neuroni raccolti.
Quindi, centrifugare la sospensione cellulare a 300 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Dopo aver scartato il surnatante, risospendere delicatamente il pellet cellulare in due o tre millilitri di terreno neurobasale completo. Seminare 100 microlitri di sospensione cellulare in ogni pozzetto per ottenere 75.000 neuroni per pozzetto, tra gli otto e i 10 giorni di coltivazione mista della glia.
Utilizzando una pipetta da 10 millilitri, lavare delicatamente i flaconi T75 con terreni di coltura gliale per raccogliere la microglia e trasferire le cellule e i terreni in una provetta conica sterile da 50 millilitri. Centrifugare la raccolta cellulare a 300 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Una volta rimosso il surnatante, risospendere delicatamente il pellet in due millilitri di terreno neurobasale completo.
Dalla piastra di coltura neuronale a 96 pozzetti, rimuovere 100 microlitri di terreno neurobasale e aggiungere 100 microlitri di 250.000 cellule per millilitro di sospensione cellulare. Nella co-coltura sono state osservate microglia rotonde e grandi sopra o tra i neuroni e i processi neuriti.
