Iniziare preparando una scorta di infezione da Pseudomonas aeruginosa di unità formanti colonie note per millilitro prima dell'infezione. Per pellettare il brodo di infezione, centrifugare a 10.000 x g per cinque minuti a temperatura ambiente. Risospendere il pellet in PBS.
Successivamente, preparare tre provette per microfugi da un millilitro contenenti acqua distillata sterile, etanolo o PBS sterile. Ispezionare una siringa Hamilton sterile da 100 microlitri, assicurandosi che la punta dell'ago sia affilata e non abbia sviluppato un uncino che potrebbe causare traumi significativi al sito di infezione. Ora lavare la siringa in sequenza con acqua distillata, etanolo e PBS prima delle infezioni, prelevando e scartando la capacità massima.
Quindi agitare l'inoculo dell'infezione risospesa e aspirare un massimo di 100 microlitri nella siringa di Hamilton, sufficienti per iniettare 10 microlitri per larva. Successivamente, iniettare ogni larva di Galleria mellonella con 10 microlitri di inoculo nella zampa anteriore posteriore destra. Incubare le larve infette tra i 20 gradi Celsius e i 42 gradi Celsius, che è un intervallo appropriato per la sopravvivenza della galleria.
Preparare un'ampia gamma di dosi che superino l'intervallo terapeutico previsto per l'agente antimicrobico, sulla base dei dati di tossicità in vitro. Iniettare la gallona, sana e sterile, la gallonella in gruppi di dimensioni appropriate con le diverse concentrazioni di antimicrobici e veicoli PBS. Per ottimizzare il trattamento dell'infezione batterica in Galleria mellonella, preparare una gamma adeguata di dosi di agenti antimicrobici sulla base di test preliminari di tossicità.
Infettare gruppi di larve con batteri come precedentemente descritto due ore dopo l'infezione. Trattare le larve con l'agente antimicrobico preparato o la soluzione di controllo del veicolo. Monitorare la sopravvivenza della Galleria mellonella a intervalli di 30 minuti o più frequentemente dal momento in cui la mortalità viene solitamente osservata per la prima volta.
Rimuovi tutte le larve morte e registra il loro momento di morte. Per confrontare l'impatto dei tempi del trattamento sulla mortalità, trattare le larve a 2, 4, 6, 9 o 12 ore dopo l'infezione e monitorare la loro sopravvivenza a intervalli di 30 minuti. La dose efficace di tobramicina variava a seconda del ceppo.
Cinque milligrammi per chilogrammo erano ottimali per PAO1 e PA14,2,5 milligrammi per chilogrammo per PAK e 10 milligrammi per chilogrammo per IST27 mucoide. Nessuna dose è risultata efficace per LESB58. Il trattamento con cinque milligrammi per chilogrammo di tobramicina a due, quattro e sei ore dopo l'infezione ha determinato una sopravvivenza di oltre il 50% delle larve di Gallonella, infettate da Plasmodium aeruginosa.
