Per impostare il saggio cinetico per i peptidi RBPR2 e STRA6, diluire in serie i peptidi RBPR2 del topo, RBPR2 mutanti e STRA6 in tampone di corsa. Aprire il software di controllo e selezionare la procedura guidata Kinetic SOAR Affinity. Nella finestra di dialogo della sequenza di iniezione, selezionare Percorso flusso 2.1 con la cella di flusso 2 come attiva e la cella di flusso 1 come riferimento.
Nella finestra di dialogo di configurazione, selezionare l'opzione Esegui cicli di avvio, inserire la soluzione come buffer, specificare il numero di cicli e fare clic su Avanti. Ora vai alla finestra di dialogo dei parametri di iniezione e inserisci i parametri del campione come il tempo di contatto di 120 secondi, la portata di 30 microlitri al minuto e il tempo di dissociazione di 300 secondi. Per i parametri di rigenerazione, impostare la soluzione di rigenerazione su acido cloridrico glicina con un tempo di contatto di 30 secondi e una portata di 30 microlitri al minuto, quindi fare clic su Avanti.
Nella finestra di dialogo dei campioni, inserisci i nomi dei peptidi, i pesi molecolari e le concentrazioni, quindi fai clic su Avanti. Nella finestra di dialogo della posizione del rack, assegnare i peptidi diluiti come singoli campioni da 120 microlitri con varie concentrazioni da uno a 100 micromolari nelle posizioni designate sul rack. Fare clic su espellere il rack e inserire tutte le fiale.
Successivamente, fare clic su Avanti, quindi nella finestra di dialogo Prepara ed esegui protocollo fare clic su Avvia. Inserisci un nome per il file e fai clic su Salva. Ora nel software, fai clic sul menu di avvio e seleziona una valutazione.
Aprire il file, quindi dal menu di selezione a discesa scegliere FC-2.1 per analizzare il sensorgram attivo sottratto vuoto della cella di riferimento per le fasi di associazione e dissociazione dei peptidi msRBP4, msRBPR2 mutante e msSTRA6. Quindi, fai clic sul pulsante a discesa Cinetica o Affinità e scegli il limite della superficie. Nella finestra di dialogo Seleziona curve, selezionare Includi colonna nella tabella e fare clic su Avanti.
Ora vai alla finestra di dialogo Seleziona dati, visualizza i sensorgram sottratti vuoti. Fare clic su Cinetica e affinità. Mantenete i parametri di default e fate clic su Adatta (Fit) per l'adattamento della curva.
Ispezionare la scheda del rapporto per verificare la presenza di costante di dissociazione di equilibrio Kd, il tasso di associazione Ka o Kon e il tasso di dissociazione Kd o Koff. Salvare il sensorgram dei dati Kinetics nella scheda di testo in un formato limitato e utilizzare i valori per tracciare i grafici.
