Per iniziare, enuclea i globi oculari del topo eutanasia e omogeneizza gli occhi in un tampone ghiacciato. Centrifugare l'omogeneizzato a 16.000 g per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Scartare il surnatante contenente proteine idrosolubili e altri contaminanti.
Quindi risospendere e solubilizzare la membrana pellettata e le proteine di membrana in un tampone per un'ora a quattro gradi Celsius su una piattaforma rotante. Successivamente, centrifugare la frazione di membrana risolubilizzata per un'ora a 16.000 g a quattro gradi Celsius. Mescolare il surnatante con 30-50 microlitri di perle di anticorpi Rho1D4 e perle di anticorpi bianchi di immunoglobulina G in due campioni indipendenti separati e incubare per un'ora a quattro gradi Celsius su una piattaforma rotante.
Utilizzando un supporto magnetico, separare il pull-down raccogliendo le perline. Scartare il surnatante e lavare le perle con un tampone ad alto e basso contenuto di sale contenente Bis-tris propano, cloruro di sodio e N-dodecil-beta-D-maltoside. Per eluire la proteina rodopsina, incubare le perle per 5-10 minuti a temperatura ambiente con un tampone da 65 microlitri della composizione data.
Quindi, utilizzando un cubito di quarzo sub-micro rettangolare da 50 microlitri con un'apertura di due millimetri e una lunghezza del percorso di 10 millimetri, analizzare l'eluato per l'assorbanza da 200 nanometri a 800 nanometri in un'impostazione di scansione rapida con uno spettrofotometro. Per convalidare e determinare la qualità, esporre l'eluato a una luce intensa per un minuto. Quindi ripetere la misurazione dell'assorbanza.
Sottrarre l'assorbanza del bianco e calcolare il rapporto degli spettri assorbenti analizzati. Quindi traccia gli spettri assorbenti sottratti in bianco e calcola il valore dell'opsina libera. Successivamente, utilizzando la legge di Beer-Lambert, calcolare la concentrazione di rodopsina, quindi calcolare la concentrazione di opsina libera da ligando e stimare la differenza di concentrazione per l'apo-opsina e l'opsina libera da ligando in quantità e percentuale.
