Per iniziare, acquisisci immagini multiview di embrioni di pesce zebra in fase iniziale utilizzando un microscopio a foglio ottico. Una volta rilevati i punti di interesse, seleziona tutte le visualizzazioni, fai clic con il pulsante destro del mouse e scegli Registrati utilizzando i punti di interesse. Per verificare il funzionamento preciso della registrazione, selezionare due visualizzazioni consecutive.
Vai alla regione sovrapposta e passa da una vista all'altra per osservare se le perline riprodotte da diverse angolazioni sono sovrapposte. Dopo aver effettuato correttamente la registrazione, fare clic su Salva nella finestra di Esplora risorse multivista per salvare il file XML aggiornato. Ora apri la perlina.
XML in un editor di testo a scelta e copiare l'intero blocco in Visualizza registrazioni. Apri l'embrione. XML e sostituire il blocco delle registrazioni della vista con il blocco copiato dal file delle perline.
Quindi apri l'embrione. XML in Big Stitcher e controlla attentamente se la registrazione ha funzionato con successo per l'embrione. Ripeti lo stesso per le perline controllando la sovrapposizione delle strutture di interesse ogni due viste consecutive.
Per eseguire la deconvoluzione multi-vista, selezionare tutte le viste nel file del perline, fare clic con il pulsante destro del mouse e scegliere le funzioni di diffusione dei punti e le opzioni di estrazione. Procedere con le dimensioni predefinite della funzione di distribuzione dei punti e fare clic su OK. Quindi salva nuovamente il file XML. Quindi, apri l'embrione.
XML e assegnare separatamente la funzione di diffusione dei punti per ciascuna vista. Fare clic con il pulsante destro del mouse su una vista, fare clic su Funzioni di diffusione dei punti, scegliere Assegna e selezionare Avanzate, quindi Assegna nuova PSF a tutte le viste selezionate. Fare clic su Sfoglia, andare al percorso del file XML e aprire la cartella PSF.
Nella vista selezionata, scegliere la funzione di distribuzione dei punti corrispondente con l'ID corrispondente e fare clic su OK. Dopo che la funzione di diffusione dei punti è stata assegnata a tutte le viste, fare clic con il pulsante destro del mouse e scegliere la deconvoluzione multi-vista. Selezionare il riquadro di delimitazione come viste attualmente selezionate. Al 70% dell'epibolia, gli embrioni assumevano orientamenti orizzontali, verticali o obliqui all'interno del tubo polimerico, con l'orizzontale che era il meno rappresentato, mentre le posizioni verticale e obliqua erano ugualmente osservate.
Quando i campioni sono stati preparati prima della gastrulazione, circa il 25% degli embrioni mostrava orientamento orizzontale. Il resto degli embrioni mostrava vari altri orientamenti allo stadio di gemma. Tuttavia, molti di loro si sono riorientati in posizione orizzontale durante la prima formazione di somiti.
Un confronto tra le immagini infuse di informazioni su scala cellulare non ha mostrato differenze significative nelle informazioni sui nuclei, ma i confini cellulari sono stati risolti meglio nel set di 30 gradi. Rispetto alle immagini di input originali, le immagini segmentate contenevano errori. Il software non è riuscito a rilevare un confine di cella o ha disegnato confini di celle inesistenti.
Il numero di errori ha aumentato drasticamente le immagini infuse ottenute dall'imaging a intervalli angolari di 45 e 60 gradi rispetto ai 30 gradi.
