Mantenere le cellule staminali pluripotenti o PSC in piastre di coltura a sei pozzetti e confermare la densità cellulare al microscopio. Per la differenziazione dei cardiomiociti o del CM, seminare le PSC in una piastra di coltura a 96 pozzetti in un terreno di preparazione PSC. Nella prima fase della differenziazione cardiaca, quando le PSC raggiungono l'80-90% di confluenza, passare dal mezzo al mezzo di differenziazione CM con CHIR da due a 20 micromolari.
Dopo 24-48 ore di trattamento CHIR, cambiare il terreno con un mezzo di differenziazione CM fresco. Nella fase due o nel terzo giorno, sostituire il terreno con il terreno di differenziazione CM integrato con cinque micromolari IWR1 in coltura fino al quinto giorno. Quindi cambia il terreno con il mezzo di differenziazione CM e mantienilo fino al sesto o settimo giorno, quando le PSC si differenziano in cellule progenitrici cardiache, o CPC.
Al giorno 10 o al giorno 12, fissare le cellule con il 4% di paraformaldeide in PBS per 15 minuti a temperatura ambiente. Al momento della colorazione, trattare le cellule con una soluzione permeabilizzante per 30 minuti a temperatura ambiente. Incubare il campione con l'anticorpo primario CTNT per una notte a quattro gradi Celsius.
Quindi trattare il campione con anticorpi secondari in PBS contenenti l'1% di albumina sierica bovina per un'ora a 37 gradi Celsius. Dopo aver rimosso l'anticorpo secondario dalle cellule, colorare i nuclei con Hoechst per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi sciacquare le cellule tre volte usando PBS prima di aggiungere 100 microlitri di PBS per pozzetto per evitare che si secchino.
Per raccogliere immagini in campo chiaro e immunofluorescenti CTNT di diversi stadi di differenziazione utilizzando un microscopio automatizzato a supporto della coltura di cellule vive, aprire il software e creare un nuovo disegno sperimentale. Scegli un obiettivo 5X e un blend 2X2 per l'imaging. Nel menu dei canali, aggiungere il canale TL per il campo chiaro e i canali AF 488 e H 33 42 per l'imaging in immunofluorescenza.
Modificare il percorso della luce nella configurazione di imaging. Nel menu Stack Z, impostare il numero di sezioni e gli intervalli durante la scansione. Nella finestra di navigazione e riquadri, imposta le regioni dei riquadri per vettore e imposta 25 riquadri cinque colonne in cinque righe per un pozzetto.
Per acquisire le immagini, inserire prima la piastra per colture cellulari nel vassoio del campione e caricare il vassoio all'interno del microscopio. Se il campione è costituito da cellule vive, aprire il sistema di riscaldamento e la pompa di anidride carbonica per mantenere le condizioni appropriate per la coltura a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Aprire il progetto sperimentale preimpostato.
Apri il menu delle tessere e calibra manualmente la posizione della piastra. Nella finestra di navigazione e riquadri, selezionare i pozzetti necessari e fare clic su Crea per costruire le regioni dei riquadri per questi pozzi. Fare clic su verifica regioni di tessere nel menu delle tessere ed eseguire la messa a fuoco automatica per verificare tutti i pozzetti.
Quindi correggere manualmente la messa a fuoco di ciascun pozzetto. Fare clic sul pulsante Avvia esperimento e attendere l'imaging automatico. In genere, sono necessarie circa 1,2 ore per scansionare un'intera piastra di coltura a 96 pozzetti.
Nel framework di elaborazione, scegli l'esportazione delle immagini, seleziona il tipo di file del formato TIFF non compresso o del formato PNG e applica.
