Per iniziare, estrai il DNA dal tessuto vegetale e determina la concentrazione di DNA. Impostare la reazione dopo aver aggiunto tutti i componenti necessari a una provetta da centrifuga da 0,2 millilitri. Dopo l'amplificazione del primer, caricare tre microlitri di prodotto PCR e due microlitri di un marcatore di DNA da 5.000 coppie di basi nei pozzetti di un gel di agarosio.
Impostare la tensione a 120 volt, la corrente a 400 milliampere ed eseguire l'elettroforesi per 40 minuti. Utilizza un versatile sistema di analisi delle immagini su gel per visualizzare e analizzare i risultati del gel. Dopo aver eseguito il campione attraverso un'unità di sequenziamento, selezionare Crea un nuovo progetto e fare clic su OK per accedere alla home page del software.
Nel menu File, selezionare Importa e aggiungi campioni. Scegliere il file in formato di traccia della sequenza e importarlo come file da elaborare in campioni non assemblati. Scegli Contig.
Passare quindi ad Assemblaggio avanzato e selezionare Assembla in gruppi. Quando viene visualizzata la finestra di dialogo che richiede di definire i nomi, modificate il nome del file nella sezione Definisci parti nome campione (define sample name parts) e fate clic su Assembla (Assemble) per visualizzare la sequenza allineata. Seleziona Vai, quindi scegli Sequenza di ricerca e fai clic su OK per trovare la sequenza corrispondente.
Scegli Contig, quindi seleziona Elimina per rimuovere le regioni 5.8S e 28S, insieme a tutte le sequenze di bassa qualità. Esporta l'output con le sequenze giuntate per la corrispondenza. Selezionare una ricerca BLAST utilizzando il database dei nucleotidi presso NCBI.
Scegli lo strumento di identificazione delle specie e il primer specifico ITS-2, corrispondente al Global Pharmacopoeia Genome Database. Scarica le sequenze di tre specie di Angelica e una specie di Peucedanum praeruptorum come outgroup da NCBI. Analizza queste sequenze insieme alle sequenze di risultati ottenute.
Quindi fare clic su File. Seleziona Apri un file o una sessione per importare il file e apparirà una finestra di dialogo. Scegliere Allinea seguito da DNA e selezionare Allinea da ClustalW per confrontare le sequenze.
Passare a filogenesi e fare clic su Costruisci albero di giunzione adiacente di prova per generare un albero filogenetico. I risultati dell'elettroforesi su gel hanno mostrato singole bande chiare intorno a 500 coppie di basi per i campioni AS1, AS2 e AS3, senza bande nel controllo negativo, indicando l'amplificazione riuscita del DNA estratto. I risultati del sequenziamento hanno identificato Angelica sinensis con una somiglianza di sequenza del 100% utilizzando BLAST, abbinando i risultati del database GPGD.
Nell'analisi filogenetica, le sequenze di splicing si sono raggruppate con Angelica sinensis OR8797150.1, con un valore di supporto bootstrap di 100, dimostrando l'identificazione come Angelica sinensis.
