Per iniziare, prepara le nanoparticelle di RNA a doppio filamento di chitosano per nutrire le larve del baco da seta. Quindi raccogli le larve di baco da seta di quinto stadio appena mutate di dimensioni simili per l'esperimento di alimentazione. Metti ogni larva singolarmente in un pozzetto di una piastra a sei pozzetti.
Coprite il piatto e fate morire di fame le larve per 24 ore. Successivamente, sciacquare le foglie di gelso fresche con acqua deionizzata e asciugarle con carta da cucina pulita. Tagliare le foglie completamente essiccate in dischi di foglie di un centimetro per un centimetro.
Sciogliere le nanoparticelle di dsRNA di chitosano in acqua priva di nucleasi a una concentrazione di 500 nanogrammi per microlitro prima dell'uso. Rivestire 10 microlitri di nanoparticelle di dsRNA di chitosano, controllare le nanoparticelle di chitosano e il dsRNA nudo separatamente sulla superficie di ciascun disco di foglie di gelso. Lasciare asciugare le soluzioni all'aria sui dischi fogliari a temperatura ambiente per cinque minuti.
Successivamente, offri ogni giorno un disco fogliare rivestito di nanoparticelle o dsRNA a ciascuna larva. Una volta che il disco fogliare rivestito è completamente consumato dalle larve, ogni giorno, fornire foglie di gelso fresche. Il sesto giorno, metti le larve sul ghiaccio finché non sono immobili.
Per sezionare le larve, taglia il torace con le forbici su una capsula di Petri pulita e usa una pinzetta per estrarre l'intestino medio. Dopo aver rimosso il contenuto. lavare l'intestino medio in una capsula di Petri con acqua priva di nucleasi.
Congelare l'intestino medio a meno 70 gradi Celsius in un tubo da 1,5 millilitri. L'alimentazione di nanoparticelle di chitosano dsRNA nei bachi da seta ha comportato una riduzione del 79% dei livelli di trascrizione di BmToll9-2 rispetto ai trattamenti di controllo. Le larve di baco da seta trattate con nanoparticelle di dsRNA di chitosano silenziante BmToll9-2 erano visibilmente più piccole delle larve di controllo.
I bozzoli delle larve silenziate di BmToll9-2 erano anche significativamente più piccoli di quelli del gruppo di controllo.
