Per derivare i macrofagi dal midollo osseo di un topo adulto wild type, placcare le cellule del midollo osseo in una piastra a fondo piatto a 96 pozzetti trattata otticamente contenente DMEM integrato con il 10% di FBS e il 10% di LCCM. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius con il 7% di anidride carbonica per 10 giorni. Dopo la differenziazione, pipettare 75 microlitri della sospensione di Mycobacterium abscessus nei macrofagi contenenti pozzetti.
Incubare le cellule a 37 gradi Celsius con il 7% di anidride carbonica per quattro ore. Utilizzando un dispenser di reagenti per micropiastre, dotato di una piccola cassetta, aggiungere 110 microlitri di DMEM integrati con il 10% di FBS e il 10% di LCCM nelle colonne di controllo dei composti o dei solventi. Erogare altri 104 microlitri di DMEM integrati con il 10% di FBS e il 10% di LCCM nelle colonne contenenti la più alta concentrazione del composto o del solvente.
Ora pipettare 5,9 microlitri dei composti o del solvente nei pozzetti designati nelle colonne. Utilizzando una micropipetta multicanale, eseguire due diluizioni seriali per ciascun composto e solvente. Dopo l'ultima diluizione, scartare i 110 microlitri di terreno in eccesso dall'ultimo pozzetto.
Aggiungere 110 microlitri di DMEM integrato con il 10% di FBS e il 10% di LCCM in tutte le colonne, esclusi i pozzetti bianchi. Preparare una soluzione di claritromicina a una concentrazione di due microgrammi per millilitro in un DMEM. Dopo l'incubazione, rimuovere dall'incubatrice la piastra a 96 pozzetti contenente i macrofagi infetti.
Utilizzando una lavatrice per piastre, lavare le celle tre volte con 200 microlitri di soluzione di lavaggio per infezioni. Trasferire 200 microlitri dei composti nella piastra contenente i macrofagi infetti. Quindi aggiungere 200 microlitri di terreno di coltura cellulare integrato e una soluzione di claritromicina nei rispettivi pozzetti.
Incubare la piastra a 37 gradi Celsius con il 7% di anidride carbonica per 48 ore. Dopo l'incubazione, lavare le cellule infette tre volte ciascuna con 200 microlitri della soluzione di lavaggio dei composti. Utilizzando una micropipetta multicanale, erogare 200 microlitri di soluzione di fissazione in tutti i pozzetti e incubare per 10 minuti.
Dopo aver lavato le cellule, trasferire 200 microlitri di soluzione permeabile in tutti i pozzetti e incubare per 15 minuti. Quindi, aspirare la soluzione permeabile prima di aggiungere 100 microlitri di soluzione colorante in tutti i pozzetti. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente.
Dopo l'incubazione, lavare le cellule tre volte con 200 microlitri di soluzione detergente del composto. Per eseguire lo screening della lastra utilizzando un sistema di imaging ad alto contenuto, selezionare il tipo di lastra come piastra da 96 microtitolazioni. Obiettivo come 20X con apertura numerica di 0,4 e modalità a confocale.
Successivamente, selezionare il canale DAPI, CellMask deep red e mCherry per catturare rispettivamente i nuclei colorati, il citoplasma e il segnale dei batteri. Selezionare i pozzetti della piastra e i rispettivi campi di ciascun pozzetto per l'analisi. Quindi, fai clic sul test e acquisisci un'immagine per verificare le impostazioni.
Infine, è possibile configurare un robot di movimentazione delle apparecchiature per automatizzare l'acquisizione delle immagini durante la notte. Questo braccio robotico sostituisce le piastre nel sistema di imaging ad alto contenuto senza l'intervento umano. I composti daunorubicina, doxorubicina, tiostrepton, epirubicina e pirvinio pamoato erano tossici per i macrofagi infettati da micobatteri portando a meno dell'85% di vitalità cellulare.
I composti moxalattam e besifloxacina avevano meno del 50% di vitalità dei micobatteri a 13,3 micromolari, ma non hanno mostrato differenze significative rispetto al controllo DMSO. I composti cefdinir, gatifloxacina e moxifloxacina erano potenti contro i micobatteri intracellulari a 13,3 micromolari con il composto pirvinio pamoato che era il più attivo. I composti, roxitromicina, claritromicina e rifabutina, hanno mostrato un'estrema potenza contro i micobatteri intracellulari con la claritromicina che riduce la vitalità del micobatterio a meno del 10% in tutte le concentrazioni.
