L&#39;autore ringrazia Barbara Berli per fornire dati di esempio e il finanziamento graziosa della Federazione canadese della fauna selvatica.

1. Cattura e acclimatazione <ol><li> Utilizzando una rete senza nodi, raccolgono i pesci dal loro serbatoio di acque usate. Ridurre al minimo la cattura del tempo, evitare di raccogliere i pesci più e non tenere i pesci per più di pochi secondi in rete come questi fattori possono aumentare lo stress. Lo stress può influire sulle prestazioni di nuoto. </li><li> Luogo pescare in una vasca di trasferimento con l&#39;anestesia o direttamente al respirometro tunnel nuoto (&#39;tunnel nuoto&#39;). Se i pesci devono essere anestetizzati, sia tricaine metanosolfonato (MS222) o di olio uno spicchio può essere utilizzato. Le concentrazioni accettabili dipenderà da molti fattori, compresa la sensibilità delle specie e la temperatura, ma in genere varia da 10-100 mg / L per entrambi 1,2 anestetico. La concentrazione di anestetico deve indurre la fase 3 l&#39;anestesia (cioè non risponde agli stimoli esterni) e consentono un rapido recupero (secondo esempio). Quando si utilizza MS222 in acqua dolce, bicarbonato di sodio deve essere utilizzato in parti uguali (in massa) come buffer. Senza buffer, MS222 ridurrà di molto il pH, basso pH e possono danneggiare i tessuti branchia. Buffer non è necessario in acqua di mare in quanto contiene una sufficiente capacità di buffering. </li><li> Pesce anestetizzato può essere sessuato, misurato per la massa e la lunghezza, e dato un esame superficiale esterno della loro condizione. Lunghezza può essere preso come lunghezza totale (TL), lunghezza delle forche (FL) o la lunghezza del corpo (BL). Queste metriche differenti vengono generalmente applicate secondo la pratica standard, morfologia specie (ad esempio non pinna biforcuta) o condizione di pesce (per esempio, pinna caudale portati via). </li><li> Sia i pesci anestetizzati e non anestetizzati dovrebbero essere introdotti nel tunnel nuotare più rapidamente possibile e in acqua corrente in quanto ciò faciliterà il recupero. La portata è solitamente impostato in modo che i pesci saranno in grado di riposare sul fondo mentre appena il nuoto. Un tasso di esempio per gli adulti salmone rosso è di 0,3 BL / s. </li><li> I pesci devono essere lasciati nel tunnel nuoto si adatti. Periodo di acclimatazione può essere impostata per periodi tradizionali (ad esempio 12 ore), oppure a quelli utilizzati nella maggior parte degli studi in corso, che può essere il più breve 30 min. Per determinare un periodo di acclimatazione ideale per un pesce dato, il tempo necessario per raggiungere una stalla, idealmente basso, il ritmo metabolico può essere utilizzato (dettagliato sezione successiva). </li></ol> 2. Misura tassi metabolici <ol><li> Variazioni di ossigeno all&#39;interno del tunnel nuoto devono essere registrate per tutta la durata del test di nuoto (s). Sonde di ossigeno può essere sigillata direttamente nel tunnel nuoto, tuttavia, deve prima verificare se il flusso d&#39;acqua sopra la sonda influenza la funzione della sonda. Se la sonda è affetto da una velocità dell&#39;acqua che possono verificarsi durante la prova, la sonda dovrà essere collocato nella sua camera al di fuori del tunnel e alimentate con acqua galleria da una pompa. </li><li> Per rifornire di ossigeno e limitare l&#39;accumulo dei rifiuti, il tunnel nuoto sarà probabilmente bisogno di essere lavati periodicamente. Saturazione di ossigeno non dovrebbe essere consentito di caduta inferiore al 70% per la maggior parte delle specie, come le prestazioni di nuoto può essere ridotto o ci può essere un cambiamento di metabolismo anaerobico. Vampate di calore acqua tunnel può anche contribuire a ridurre eventuali aumenti di temperatura dell&#39;acqua, tuttavia, la temperatura dell&#39;acqua deve essere mantenuta costante, associando la galleria nuotare ad un refrigeratore. Cambiamenti nella temperatura influenzano il tasso metabolico. </li><li> Tassi metabolici di routine e massime, abbreviato &#39;RMR&#39; e &#39;MMR&#39;, sono tipicamente determinato (Figura 1A). Questi tassi possono essere espressi in volume (V o 2) o di massa (M o 2) di ossigeno per unità di massa, per unità di tempo, ad esempio O 2 mg / kg / ora. La differenza tra i due tassi possono essere intraprese per ottenere il &#39;margine per l&#39;attività&#39;. Nell&#39;esercizio seguente il &#39;debito di ossigeno&#39;, denominato &#39;eccesso di post-esercizio del consumo di ossigeno&#39; (EPOC), può anche essere determinata ed è uguale a l&#39;ossigeno necessario durante il post-esercizio ritorno RMR. </li></ol><ol><li> Nota: le sonde di ossigeno molti e la loro produzione fornirà automaticamente la temperatura corretta con variazioni di ossigeno disciolto. Quelli che non avrà bisogno di essere corretto. Inoltre, alcuni valori dovranno essere corretti se le misurazioni sono state condotte in condizioni saline. </li></ol> Misurazione della performance di nuoto Una varietà di abilità prestazioni di nuoto possono essere valutate in un tunnel nuotare. Il modo più comune per caratterizzare le prestazioni nuoto è dalla durata per i quali può essere mantenuta 3. Più lenta è la velocità, il più a lungo può essere mantenuta e viceversa. Le velocità sono generalmente indicate come &#39;scoppiare&#39;, &#39;prolungato&#39; o &#39;sostenuta&#39;, che corrispondono a durate di secondi, minuti a ore (max = 200 min), e ore e oltre (&gt; 200 min), rispettivamente. Per determinare queste velocità, i pesci sono sottoposti a definiti dall&#39;utente &#39;passi&#39;, composto di &#39;height&#39; impostata, cioè aumentare la velocità del flusso d&#39;acqua, e &#39;lunghezza&#39;, cioè la durata passo. Massimizzare l&#39;altezza e la lunghezza del passo passo minimizzando catturerà la velocità massima raffica, mentre si fa il contrario di catturare la massima velocità sostenuta. Nel passotest, il tradizionale modo di riportare la velocità massima raggiunta è pari alla velocità della ultimo passo completato oltre alla parte temporale della finale, passo incompiuto (Figura 1A). Burst nuoto di valutazione delle prestazioni <ol><li> Per catturare il nuoto scoppiare o capacità sprint, a seguito di acclimatazione, portare la velocità del flusso ad un massimo stimato (ad esempio due volte crit U; vedi sotto), e motivare il pesce a nuotare. I pesci devono essere appoggiata sul retro della camera, come la velocità del flusso è rapidamente aumentato. Pesce può avere bisogno di essere motivati ​​a fare il bagno. La motivazione può essere meccanica (touch ad esempio) o elettrica (ad esempio una piccola carica applicata ad una griglia d&#39;urto nella parte posteriore del tunnel nuoto). Per quanto non espressamente una prova di abilità scoppio, i pesci possono anche essere dato un &#39;test di accelerazione costante&#39; (CAT o U ΔV) costituito da diverse fasi di breve durata (es. 1 min) 4,5. </li><li> Registrare la durata del nuoto. Il numero di scoppiare individuali e la loro distanza può anche essere registrati 6. La velocità può essere dato come massima raggiunta o calcolata secondo l&#39;equazione nella Figura 1A. Prolungata e sostenuta nuoto di valutazione delle prestazioni La misura più frequentemente utilizzata per stimare la capacità di nuoto prolungato o prolungato è indicato come &#39;prestazioni nuoto critica&#39; (crit U). Lunghezza del passo per crit U è tradizionalmente stato fissato a 20 minuti, anche se più brevi i tempi come 10 minuti sono stati utilizzati. Una regola generale è che almeno dieci passi dovrebbero essere presi prima di stanchezza, che può portare a lunghi test, ad esempio&gt; 3 ore / pesce. Per abbreviare il test crit U, i primi sette passi può essere abbreviato a 5 min (il test viene poi definito &#39;rampa di U-critico&#39;). </li></ol><ol><li> A seguito di acclimatazione e / o una nuotata pratica, aumentare la velocità del flusso secondo la fase dimensioni. </li><li> Per impostare l&#39;altezza appropriata passo per crit U, sarà probabilmente necessario stimare critico U per un campione del pesce da testare. Questo può essere ottenuto utilizzando i valori della letteratura. In alternativa, il pesce può essere attribuito un &#39;nuotare pratica&#39; dopo l&#39;introduzione al tunnel. Per questo, dare pesce brevi, definiti dall&#39;utente passi, finché la stanchezza. Utilizzare la velocità finale raggiunta come una stima iniziale di crit U. Regola la dimensione del passo (altezza e lunghezza) per ogni pesce. </li><li> Per testare la capacità di recupero o determinare variazioni individuali nelle prestazioni, il pesce può essere dato un secondo test di nuoto dopo un periodo di recupero 7-9. </li><li> I pesci possono anche essere testate in scuole, anche se i pesci tendono a fatica in tempi diversi durante le prove cui può essere problematico per rimuoverli dal tunnel ed eliminare la capacità di misurare l&#39;assorbimento di ossigeno. </li><li> Una volta affaticato, il pesce dovrebbe essere consentito di recuperare o rimosso immediatamente per il prelievo dei tessuti. Metriche di performance diverse legate al nuoto possono essere raccolti durante le prove o dopo l&#39;utilizzo di analisi video (Figura 1 C, D). </li><li> Per misurare la velocità di ventilazione e battere la frequenza coda, il tasso di opercolare di pompaggio e il numero di battiti coda deve essere campionato per periodi di alcuni secondi (Figura 1B) 10,11. </li><li> Per misurare l&#39;ampiezza battere la coda, la deformazione massima della pinna caudale può essere misurata (Figura 1B) 12. </li><li> Dopo test, i pesci possono essere eutanasia, dato un esame post-mortem e tessuti raccolti per determinare ematocrito (imballato il volume dei globuli rossi), le concentrazioni di ormone dello stress, immagazzina energia muscolare (per esempio fosfocreatina, glicogeno), attività enzimatica (ad es lattato deidrogenasi, esterasi acetilcolina ), o altri parametri fisiologici. </li></ol> 3. Rappresentante Risultati <img src="/files/ftp_upload/2572/2572fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. A) Un esempio rampa test U crit dato a un salmonidi giovanile, un vivaio sollevato trota iridea (Oncorhynchus mykiss), g 6,3 centimetri in lunghezza del corpo (BL) e 3,5 in massa. Il test è stato effettuato in un L 12 modificato Brett tipo respirometro (Loligo Systems, Danimarca; <a href="http://www.loligosystems.com/">www.loligosystems.com</a> ). Tassi metabolici di routine e massimi sono stati calcolati come pendenza (mg / ora) x volume (L) / pesce massa (kg), e sono stati 198 e 961 mg O 2 / kg / ora, rispettivamente, (spazio per attività = 4,84). Questi tassi sono in linea con quelli riportati da Brett giovanile per sockeye salmone (O. nerka) 13. Nota: per i calcoli di consumo di ossigeno, il volume d&#39;acqua pari al volume respirometro meno volume di pesce. La croce indica il punto dove il pesce si rifiutò di fare il bagno e dove più crit U è stata calcolata. B) Coda valori di frequenza di battimento sono stati registrati oltre 10 s sei volte; coda valori di ampiezza battere sono stati registrati tre volte; valori indicatisono media ± SEM. C) Una vista laterale ampliata e D) vista dall&#39;alto dei pesci che nuotano all&#39;interno della camera di nuotare. D) Mostra i pesci monitorati da EthoVision software (Noldus, Paesi Bassi; <a href="http://www.noldus.com/">www.noldus.com</a> ). Abbreviazioni: crit U = velocità critica di nuoto; U f = velocità l&#39;ultimo passaggio completato, U s = velocità del passo, t f = tempo trascorso in ultimo passo, t s = tempo di passo.

<ol>
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Biol. 207, 2979-2990 (2004).</li><li>Marras, S., Claireaux, G., McKenzie, D. J., Nelson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+variation+and+repeatability+in+aerobic+and+anaerobic+swimming+performance+of+European+sea+bass,+Dicentrarchus+labrax.">Individual variation and repeatability in aerobic and anaerobic swimming performance of European sea bass, Dicentrarchus labrax.</a> J. Exp. Biol. 213, 26-32 (2010).</li><li>Kolok, A. S., Plaisance, E. P., Abdelghani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Individual+variation+in+the+swimming+performance+of+fishes:+an+overlooked+source+of+variation+in+toxicity+studies.">Individual variation in the swimming performance of fishes: an overlooked source of variation in toxicity studies.</a> Environ. Toxicol. Chem. 17, 282-285 (1998).</li><li>Tierney, K. B., Farrell, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relationships+between+fish+health,+metabolic+rate,+swimming+performance+and+recovery+in+return-run+sockeye+salmon,+Oncorhynchus+nerka+(Walbaum).">The relationships between fish health, metabolic rate, swimming performance and recovery in return-run sockeye salmon, Oncorhynchus nerka (Walbaum).</a> J. Fish Dis. 27, 663-671 (2004).</li><li>Webber, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Upstream+swimming+performance+of+adult+white+sturgeon:+Effects+of+partial+baffles+and+a+ramp.">Upstream swimming performance of adult white sturgeon: Effects of partial baffles and a ramp.</a> Trans. Am. Fish. Soc. 136, 402-408 (2007).</li><li>Farrell, A. P., Gamperl, A. K., Birtwell, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+swimming,+recovery+and+repeat+swimming+performance+of+mature+sockeye+salmon+Oncorhynchus+nerka+exposed+to+moderate+hypoxia+and+pentachlorophenol.">Prolonged swimming, recovery and repeat swimming performance of mature sockeye salmon Oncorhynchus nerka exposed to moderate hypoxia and pentachlorophenol.</a> J. Exp. Biol. 201, 2183-2193 (1998).</li><li>Flammang, B. E., Lauder, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Speed-dependent+intrinsic+caudal+fin+muscle+recruitment+during+steady+swimming+in+bluegill+sunfish,+Lepomis+macrochirus.">Speed-dependent intrinsic caudal fin muscle recruitment during steady swimming in bluegill sunfish, Lepomis macrochirus.</a> J. Exp. Biol. 211, 587-598 (2008).</li><li>Brett, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+respiratory+metabolism+and+swimming+performance+of+young+sockeye.">The respiratory metabolism and swimming performance of young sockeye.</a> J. Fish. Res. Board Can. 21, 1183-1226 (1964).</li><li>Bla&#382;ka, P., Volf, M., &#268;epela, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+type+of+respirometer+for+the+determination+of+the+metabolism+of+fish+in+an+active+state.">A new type of respirometer for the determination of the metabolism of fish in an active state.</a> Physiol. Bohemoslov. 9, 553-558 (1960).</li><li>Peake, S. J., Farrell, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatigue+is+a+behavioural+response+in+respirometer+confined+smallmouth+bass.">Fatigue is a behavioural response in respirometer confined smallmouth bass.</a> J. Fish Biol. 68, 1742-1755 (2006).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

In un ambiente naturale, i comportamenti di fuga come predatore e la migrazione dipende dalla capacità di nuotare ad intensità specifiche per tempi diversi. In un ambiente di laboratorio, nuotare respirometri tunnel e aumenta intervenuto velocità può essere usato per valutare la capacità dei pesci di eseguire numerosi comportamenti. Misure di tasso metabolico e altri tessuti a livello valutazioni (come la produzione di lattato) possono essere inclusi con prove di nuoto per aiutare a determinare i meccanismi fisiologici alla base diversi modi di nuoto. Galleria di design nuotare può notevolmente influenzare le prestazioni di nuoto. Ci sono diversi tipi di tunnel nuoto utilizzato per determinare le prestazioni di nuoto, la maggior parte sono caratterizzati sia come Brett 13 - o 14-Blazka tipi. Sia per la progettazione, considerazioni importanti sono la &#39;regolarità&#39; del flusso d&#39;acqua (come rettilineo è), la velocità massima portata e la lunghezza della camera di nuotare. Uniformità è importante perché i pesci si trovano istintivamente e nuotare in zone a basso flusso per ridurre al minimo sforzo. Alta velocità di flusso potenziale può essere necessario verificare la capacità di nuoto scoppio o specie nuoto veloce (ad esempio tonni). Nuotare lunghezza della camera può essere molto significativo come in sezioni di lunghezza piccola, lunghezza pesce cioè&gt; 10% della lunghezza della camera, i pesci possono non essere in grado di utilizzare tutte le modalità di nuoto. In particolare, piccoli tubi possono limitare la capacità dei pesci di transizione da una costante di instabilità cancello nuoto, cioè al nuoto scoppiare e la costa. Pertanto, il pesce potrebbe smettere di nuotare approssimativamente alla stessa velocità indipendentemente dalla lunghezza del passo e crit U può essere analogo a &#39;velocità di transizione cancello&#39; 15. Tutte le gallerie nuotare bisogno di essere calibrato usando dispositivi come le sonde di flusso o di imaging velocimetria delle particelle (PIV) attrezzature. Idealmente nuotare tunnel avrà flusso rettilineo, ma se i pesci si trovano a favorire una zona, la loro velocità di nuoto può essere regolata in base alle differenze locali nel flusso.

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>tricaine methanesulfonate (MS222)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td><a href="http://www.argent-labs.com">www.argent-labs.com</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Optional</td>
</tr>
<tr>
<td>Clove oil</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pharmacy or <a href="http://www.sigmaaldrich.com">www.sigmaaldrich.com</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Optional</td>
</tr>
<tr>
<td>Swim tunnel respirometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Custom made or <a href="http://www.loligosystems.com">www.loligosystems.com</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Required</td>
</tr>
<tr>
<td>High speed cameras</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Numerous sources</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>optional</td>
</tr>
<tr>
<td>Video capture card</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Numerous sources</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>optional</td>
</tr>
<tr>
<td>Behaviour analysis software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td><a href="http://www.noldus.com">www.noldus.com</a> <a href="http://www.cleversysinc.com">www.cleversysinc.com</a> <a href="http://www.loligosystems.com">www.loligosystems.com</a> <a hre</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>optional</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

swimming performance assessment in fishes

Test di performance nuoto dei pesci sono state parte integrante degli studi di energetica muscolare, meccanica nuoto, scambi gassosi, fisiologia cardiaca, le malattie, l&#39;inquinamento, l&#39;ipossia e la temperatura. Questo documento descrive un protocollo flessibile per valutare le prestazioni di nuoto pesce con apparecchiature in cui la velocità dell&#39;acqua può essere controllato. Il protocollo prevede da uno a molti un passo aumenta la velocità di flusso che hanno lo scopo di causare pesce alla fatica. Velocità di passo e la loro durata può essere impostato per l&#39;acquisizione di diverse abilità di nuoto rilevanza fisiologica ed ecologica. Il più delle volte passo è impostato per determinare la velocità critica di nuoto (crit U), che ha lo scopo di catturare la massima capacità sostenuta nuoto. Tradizionalmente questo test si compone di circa dieci passi ognuno di durata 20 min. Tuttavia, passi di durata più breve (es. 1 min) sono sempre più utilizzati per catturare la capacità di accelerazione o raffiche di nuoto. Indipendentemente dalla dimensione del passo, le prove di nuoto possono essere ripetute nel tempo per misurare variazioni individuali e la capacità di recupero. Gli endpoint relativi al nuoto come le misure di tasso metabolico, l&#39;uso delle pinne, tasso di ventilazione e di comportamento, come la distanza tra i banchi di pesci, spesso sono inclusi prima, durante e dopo il test di nuoto. Data la diversità delle specie di pesci, il numero delle domande di ricerca inesplorate, e l&#39;importanza di molte specie di ecologia globale e la salute economica, gli studi di performance pesci che nuotano rimarrà popolare e prezioso per il prossimo futuro.

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Swimming Performance Assessment in Fishes

La vita della maggior parte dei pesci si basano sul nuoto. Questo protocollo descrive le tecniche per la cattura di una gamma di nuoto modalità disponibili per singoli pesci e la scolarizzazione, e comprende le metriche associate nuoto con la fisiologia e del comportamento.

La valutazione delle prestazioni nuoto in Pesci

Swimming performance tests of fish have been integral to studies of muscle energetics, swimming mechanics, gas exchange, cardiac physiology, disease, ...

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Research

JoVE Journal

Biology

25.4K Views.  University of Alberta. La vita della maggior parte dei pesci si basano sul nuoto. Questo protocollo descrive le tecniche per la cattura di una gamma di nuoto modalità disponibili per singoli pesci e la scolarizzazione, e comprende le metriche associate nuoto con la fisiologia e del comportamento.

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Respirometric Oxidative Phosphorylation Assessment in Saponin-permeabilized Cardiac Fibers

Investigation of mitochondrial function represents an important parameter of cardiac physiology as mitochondria are involved in energy metabolism, oxidative stress, apoptosis, aging, mitochondrial encephalomyopathies and drug toxicity. Given this, technologies to measure cardiac mitochondrial function are in demand. One technique that employs an integrative approach to measure mitochondrial function is respirometric oxidative phosphorylation (OXPHOS) analysis.
The principle of respirometric OXPHOS assessment is centered around measuring oxygen concentration utilizing a Clark electrode. As the permeabilized fiber bundle consumes oxygen, oxygen concentration in the closed chamber declines. Using selected substrate-inhibitor-uncoupler titration protocols, electrons are provided to specific sites of the electron transport chain, allowing evaluation of mitochondrial function. Prior to respirometric analysis of mitochondrial function, mechanical and chemical preparatory techniques are utilized to permeabilize the sarcolemma of muscle fibers. Chemical permeabilization employs saponin to selectively perforate the cell membrane while maintaining cellular architecture.
This paper thoroughly describes the steps involved in preparing saponin-skinned cardiac fibers for oxygen consumption measurements to evaluate mitochondrial OXPHOS. Additionally, troubleshooting advice as well as specific substrates, inhibitors and uncouplers that may be used to determine mitochondria function at specific sites of the electron transport chain are provided. Importantly, the described protocol may be easily applied to cardiac and skeletal tissue of various animal models and human samples.

Saponin-permeabilized fiber preparation in conjunction with respirometric oxidative phosphorylation analysis provides integrative assessment of mitochondrial function. Mitochondrial respiration in physiological and pathological states can reflect various regulatory influences including mitochondrial interactions, morphology and biochemistry.

Respirometriche valutazione fosforilazione ossidativa in fibre cardiache saponina permeabilizzate

Investigation of mitochondrial function represents an important parameter of cardiac physiology as mitochondria are involved in energy metabolism, ...

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Biologia

Endurance Training Protocol and Longitudinal Performance Assays for Drosophila melanogaster

One of the most pressing problems facing modern medical researchers is the surging levels of obesity, with the consequent increase in associated disorders such as diabetes and cardiovascular disease 1-3. An important topic of research into these associated health problems involves the role of endurance exercise as a beneficial intervention.
Exercise training is an inexpensive, non-invasive intervention with several beneficial results, including reduction in excess body fat 4, increased insulin sensitivity in skeletal muscle 5, increased anti-inflammatory and antioxidative responses 6, and improved contractile capacity in cardiomyocytes 7. Low intensity exercise is known to increase mitochondrial activity and biogenesis in humans 8 and mice, with the transcriptional coactivator PGC1-&alpha; as an important intermediate 9,10. 
Despite the importance of exercise as a tool for combating several important age-related diseases, extensive longitudinal genetic studies have been impeded by the lack of an endurance training protocol for a short-lived genetic model species. The variety of genetic tools available for use with Drosophila, together with its short lifespan and inexpensive maintenance, make it an appealing model for further study of these genetic mechanisms. With this in mind we have developed a novel apparatus, known as the Power Tower, for large scale exercise-training in Drosophila melanogaster 11. The Power Tower utilizes the flies' instinctive negative geotaxis behavior to repetitively induce rapid climbing. Each time the machine lifts, then drops, the platform of flies, the flies are induced to climb. Flies continue to respond as long as the machine is in operation or until they become too fatigued to respond. Thus, the researcher can use this machine to provide simultaneous training to large numbers of age-matched and genetically identical flies. Additionally, we describe associated assays useful to track longitudinal progress of fly cohorts during training.

Endurance Training Protocol and Longitudinal Performance Assays for Drosophila melanogaster

We describe the first endurance training protocol for an important genetic model species, Drosophila melanogaster, and outline several assays to chart improvements in mobility following training.

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One of the most pressing problems facing modern medical researchers is the surging levels of obesity, with the consequent increase in associated disorders ...

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an oil-coated graduated cylinder; landing height provided a measure of flight performance by assessing how far flies will fall before producing enough thrust to make contact with the wall of the cylinder. Here we describe an updated version of the flight tester with four major improvements. First, we added a &#34;drop tube&#34; to ensure that all flies enter the flight cylinder at a similar velocity between trials, eliminating variability between users. Second, we replaced the oil coating with removable plastic sheets coated in Tangle-Trap, an adhesive designed to capture live insects. Third, we use a longer cylinder to enable more accurate discrimination of flight ability. Fourth we use a digital camera and imaging software to automate the scoring of flight performance. These improvements allow for the rapid, quantitative assessment of flight behavior, useful for large datasets and large-scale genetic screens.

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

Here we describe a method for rapid and accurate measurement of flight performance in Drosophila, enabling high-throughput screening.

Un metodo migliore per precisa e rapida misurazione delle performance in volo<em&gt; Drosophila</em

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an ...

A Method for Selecting Structure-switching Aptamers Applied to a Colorimetric Gold Nanoparticle Assay

Small molecules provide rich targets for biosensing applications due to their physiological implications as biomarkers of various aspects of human health and performance. Nucleic acid aptamers have been increasingly applied as recognition elements on biosensor platforms, but selecting aptamers toward small molecule targets requires special design considerations. This work describes modification and critical steps of a method designed to select structure-switching aptamers to small molecule targets. Binding sequences from a DNA library hybridized to complementary DNA capture probes on magnetic beads are separated from nonbinders via a target-induced change in conformation. This method is advantageous because sequences binding the support matrix (beads) will not be further amplified, and it does not require immobilization of the target molecule. However, the melting temperature of the capture probe and library is kept at or slightly above RT, such that sequences that dehybridize based on thermodynamics will also be present in the supernatant solution. This effectively limits the partitioning efficiency (ability to separate target binding sequences from nonbinders), and therefore many selection rounds will be required to remove background sequences. The reported method differs from previous structure-switching aptamer selections due to implementation of negative selection steps, simplified enrichment monitoring, and extension of the length of the capture probe following selection enrichment to provide enhanced stringency. The selected structure-switching aptamers are advantageous in a gold nanoparticle assay platform that reports the presence of a target molecule by the conformational change of the aptamer. The gold nanoparticle assay was applied because it provides a simple, rapid colorimetric readout that is beneficial in a clinical or deployed environment. Design and optimization considerations are presented for the assay as proof-of-principle work in buffer to provide a foundation for further extension of the work toward small molecule biosensing in physiological fluids.

A protocol is provided to select structure-switching aptamers for small molecule targets based on a tunable stringency magnetic bead selection method. Aptamers selected with structure-switching properties are beneficial for assays that require a conformational change to signal the presence of a target, such as the described gold nanoparticle assay.

Un metodo per la selezione di aptameri-struttura di commutazione Applicato ad una colorimetrico oro nanoparticelle Assay

Small molecules provide rich targets for biosensing applications due to their physiological implications as biomarkers of various aspects of human health ...

Design and Development of Aptamer&#8211;Gold Nanoparticle Based Colorimetric Assays for In-the-field Applications

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle (AuNP) colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field applications was examined. Target selective AuNP based color assays have been developed in controlled proof-of-concept laboratory settings. However, these schemes have not been exerted to a point of failure to determine their practical use beyond laboratory settings. This work describes a generic approach to design, develop, and troubleshoot an aptamer-AuNP colorimetric assay for small molecule analytes and using the assay for in-the-field settings. The assay is advantageous because adsorbed aptamers passivate the nanoparticle surfaces and provide a means to reduce and eliminate false positive responses to non-target analytes. Transitioning this system to practical uses required defining not only the shelf-life of the aptamer-AuNP assay, but establishing methods and procedures for extending the long-term storage capabilities. Also, one of the recognized concerns with colorimetric readout is the burden placed on analysts to accurately identify often subtle changes in color. To lessen the responsibility on analysts in the field, a color analysis protocol was designed to perform the color identification duties without the need for performing this task on laboratory grade equipment. The method for creating and testing the data analysis protocol is described. However to understand and influence the design of adsorbed aptamer assays, the interactions associated with the aptamer, target, and AuNPs require further study. The knowledge gained could lead to tailoring aptamers for improved functionality.

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field applications was examined. Additionally, a smart-device colorimetric application (app) was validated and long-term storage of the assay was established for use in the field.

Progettazione e sviluppo di aptameri delle nanoparticelle d&#39;oro Based colorimetriche saggi per applicazioni in-the-field

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle (AuNP) colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field ...

A Protocol for Using Gene Set Enrichment Analysis to Identify the Appropriate Animal Model for Translational Research

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison techniques resulted in contradictory conclusions regarding the relevance of animal models for translational research. A major reason for the discrepancies between different gene expression analyses is the arbitrary filtering of differentially expressed genes. Furthermore, the comparison of single genes between different species and platforms often is limited by technical variance, leading to misinterpretation of the con/discordance between data from human and animal models. Thus, standardized approaches for systematic data analysis are needed. To overcome subjective gene filtering and ineffective gene-to-gene comparisons, we recently demonstrated that gene set enrichment analysis (GSEA) has the potential to avoid these problems. Therefore, we developed a standardized protocol for the use of GSEA to distinguish between appropriate and inappropriate animal models for translational research. This protocol is not suitable to predict how to design new model systems a-priori, as it requires existing experimental omics data. However, the protocol describes how to interpret existing data in a standardized manner in order to select the most suitable animal model, thus avoiding unnecessary animal experiments and misleading translational studies.

We provide a standardized protocol for the use of gene set enrichment analysis of transcriptomic data to identify an ideal mouse model for translational research. 
This protocol can be used with DNA microarray and RNA sequencing data and can further be extended to other omics data if data are available.

Un protocollo per l'utilizzo di Gene imposta analisi di arricchimento per identificare il modello animale adeguato per la ricerca traslazionale

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison ...

Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, implantation of transgenic cells and tiny optical sensors. However, intravenous microinjections into small animals, which are mostly used in biological and veterinary laboratories, are very difficult and require trained personnel. Herein, we demonstrate a robust and efficient method for the introduction of microparticles into the circulatory system of adult zebrafish (Danio rerio) by injection into the fish kidney. To visualize the introduced microparticles in the vasculature, we propose a simple intravital imaging technique in fish gills. In vivo monitoring of the zebrafish blood pH was accomplished using an injected microencapsulated fluorescent probe, SNARF-1, to demonstrate one of the possible applications of the described technique. This article provides a detailed description of the encapsulation of pH-sensitive dye and demonstrates the principles of the quick injection and visualization of the obtained microcapsules for in vivo recording of the fluorescent signal. The proposed method of injection is characterized by a low mortality rate (0-20%) and high efficiency (70-90% success), and it is easy to institute using commonly available equipment. All described procedures can be performed on other small fish species, such as guppies and medaka.

This article demonstrates the principles of a quick, minimally invasive injection of fluorescent microparticles into the circulatory system of small fishes and the in vivo visualization of the microparticles in fish blood.

Amministrazione semplice ed efficace e la visualizzazione di microparticelle nell'apparato circolatorio di piccoli pesci mediante l'inserimento di rene

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, ...

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Ca2+-signaling is essential to normal sperm cell function and male fertility. Similarly, the acrosome reaction is vital for the ability of a human sperm cell to penetrate the zona pellucida and fertilize the egg. It is therefore of great interest to test compounds (e.g., environmental chemicals or drug candidates) for their effect on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm either to examine the potential adverse effects on human sperm cell function or to investigate a possible role as a contraceptive. Here, two medium-throughput assays are described: 1) a fluorescence-based assay for assessment of effects on Ca2+-signaling in human sperm, and 2) an image cytometric assay for assessment of acrosome reaction in human sperm. These assays can be used to screen a large number of compounds for effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm. Furthermore, the assays can be used to generate highly specific dose-response curves of individual compounds, determine potential additivity/synergism for two or more compounds, and to study the pharmacological mode of action through competitive inhibition experiments with CatSper inhibitors.

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Here, two medium-throughput assays for assessment of effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm are described. These assays can be used to quickly and easily screen large amounts of compounds for effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm.

Medio-throughput Screening Test per la valutazione degli effetti sulla Ca2 +-segnalazione e reazione acrosomiale in sperma umano

Ca2+-signaling is essential to normal sperm cell function and male fertility. Similarly, the acrosome reaction is vital for the ability of a human sperm ...

Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these independently derived phenotypes, which share a common genetic architecture. This is perhaps best exemplified by the numerous convergent features of gymnotiforms and mormyrids, two species-rich teleost clades that produce and detect weak electric fields and are called weakly electric fish. In the 50 years since the discovery that weakly electric fish use electricity to sense their surroundings and communicate, a growing community of scientists has gained tremendous insights into evolution of development, systems and circuits neuroscience, cellular physiology, ecology, evolutionary biology, and behavior. More recently, there has been a proliferation of genomic resources for electric fish. Use of these resources has already facilitated important insights with regards to the connection between genotype and phenotype in these species. A major obstacle to integrating genomics data with phenotypic data of weakly electric fish is a present lack of functional genomics tools. We report here a full protocol for performing CRISPR/Cas9 mutagenesis that utilizes endogenous DNA repair mechanisms in weakly electric fish. We demonstrate that this protocol is equally effective in both the mormyrid species Brienomyrus brachyistius and the gymnotiform Brachyhypopomus gauderio by using CRISPR/Cas9 to target indels and point mutations in the first exon of the sodium channel gene scn4aa. Using this protocol, embryos from both species were obtained and genotyped to confirm that the predicted mutations in the first exon of the sodium channel scn4aa were present. The knock-out success phenotype was confirmed with recordings showing reduced electric organ discharge amplitudes when compared to uninjected size-matched controls.

Here, a protocol is presented to produce and rear CRISPR/Cas9 genome knockout electric fish. Outlined in detail are the required molecular biology, breeding, and husbandry requirements for both a gymnotiform and a mormyrid, and injection techniques to produce Cas9-induced indel F0 larvae.

Silenziamento della scintilla: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these ...

An Air-liquid Interface Bronchial Epithelial Model for Realistic, Repeated Inhalation Exposure to Airborne Particles for Toxicity Testing

For toxicity testing of airborne particles, air-liquid interface (ALI) exposure systems have been developed for in vitro tests in order to mimic realistic exposure conditions. This puts specific demands on the cell culture models. Many cell types are negatively affected by exposure to air (e.g., drying out) and only remain viable for a few days. This limits the exposure conditions that can be used in these models: usually relatively high concentrations are applied as a cloud (i.e., droplets containing particles, which settle down rapidly) within a short period of time. Such experimental conditions do not reflect realistic long-term exposure to low concentrations of particles. To overcome these limitations the use of a human bronchial epithelial cell line, Calu-3 was investigated. These cells can be cultured at ALI conditions for several weeks while retaining a healthy morphology and a stable monolayer with tight junctions. In addition, this bronchial model is suitable for testing the effects of repeated exposures to low, realistic concentrations of airborne particles using an ALI exposure system. This system uses a continuous airflow in contrast to other ALI exposure systems that use a single nebulization producing a cloud. Therefore, the continuous flow system is suitable for repeated and prolonged exposure to airborne particles while continuously monitoring the particle characteristics, exposure concentration, and delivered dose. Taken together, this bronchial model, in combination with the continuous flow exposure system, is able to mimic realistic, repeated inhalation exposure conditions that can be used for toxicity testing.

Described is the cell culture and exposure method of an in vitro bronchial model for realistic, repeated inhalation exposure to particles for toxicity testing.

Un modello epiteliale bronchiale interfaccia aria-liquido per un'esposizione realistica e ripetuta all'inalazione alle particelle trasportate dall'aria per i test di tossicità

For toxicity testing of airborne particles, air-liquid interface (ALI) exposure systems have been developed for in vitro tests in order to mimic realistic ...