Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento della NHLBI a RW.

1. Potenza di installazione e funzionamento Torre <ol><li> La torre di alimentazione è collocato su un pezzo rettangolare di compensato che è fissata ad una tabella. A rpm 4,5 motoriduttore da Grainger poggia sulla cima di quattro 2 &quot;x6&quot; tavole ¾ di pollice e una tavola di compensato. Il motore, un alimentatore AC / DC il controllo della velocità, un fusibile e un interruttore on / off sono collegati insieme in una scatola di giunzione. </li><li> Per raffreddare il motore, un foro 3 pollici di diametro è tagliata in verticale ½ pollice pezzo di compensato. Da un lato, un 3-pollici ventola è attaccato al compensato, e dall&#39;altro, un 3-pollici cilindro di metallo di diametro è fissato. </li><li> Una misura braccio rotante con un rullo montato sulla estremità è collegata al motore. Il motore e braccio attaccato ruotare in senso orario, spingendo in basso un lato di un piegato ¾ di pollice quadrato archivio di tubo che è attaccato al compensato con una cerniera della porta. Una ruota è fissato al lato superiore del magazzino tubo sotto la piattaforma per permettere a rotolare contro la piattaforma che è dirRecuperare il liquido direttamente sopra di esso. </li><li> Il braccio spinge verso il basso su una estremità del magazzino tubo e solleva l&#39;estremità opposta, sollevando a due livelli piattaforma (Figura 1D). Quando il rullo sul braccio cancella la fotografia tubo permette al braccio di ritornare alla posizione iniziale, la piattaforma cadere giù (figura 1F). </li><li> Le piattaforme sono costituiti da rack che sono posti sulla parte superiore del compensato e assicurata da corde elastiche che vengono agganciati occhi di vite. Le piattaforme far scorrere su e giù lungo cursori cassetto che sono attaccati al compensato con staffe. </li><li> I flaconi sono posti nelle rastrelliere e fissato da uno schermo griglia quadrata che si tiene a posto con corde elastiche. </li><li> Un cuscino Styrofoam è posto sotto la piattaforma per attenuare lo shock della caduta. </li><li> La potenza del motore è regolata in modo tale che un periodo completo di rotazione è di 15 secondi. </li></ol> 2. Esercizio del protocollo <ol><li> Le mosche sono alloggiati in un incubatore a 25 ° C con 50% di umidità e 12 ore di luce / dark ciclo. Sia l&#39;esercizio fisico e la valutazione della capacità di esercizio si svolgano in 25 ° C a temperatura controllata ambiente. </li><li> Mosche vengono raccolti e di pari età entro 1-2 giorni l&#39;uno dall&#39;altro. Un minimo di 240 mosche è necessario per il monitoraggio longitudinale di geotassi resistenza e negativi (arrampicata) capacità, due indicatori fisiologici che riflettono gli effetti di allenamento. Monitoraggio longitudinale permette l&#39;isolamento di cambiamento indotto relativo ai valori di base per ciascuna coorte, senza gli effetti confondenti di variazione tra coorti. Vola per ulteriori esperimenti devono essere raccolti in base alle esigenze. </li><li> Dopo la raccolta, mosche sono suddivisi in 120 mosche sperimentali, che saranno sottoposti al regime di esercizio, e 120 vola di controllo, che non verrà esercitata. Le mosche sono conservati in flaconi da 20 battono. Le fiale di mosche sperimentali sono collegate con Flugs fermi acetato di cellulosa e le fiale di controllo (non esercitate) mosche sono collegato con morbidi spotappi in ESN, che può essere spinta verso il basso per immobilizzare le mosche, mentre il Power Tower. Spugna viene usato per immobilizzare perché la dimensione adattativa facile posizionamento in prossimità del fondo della fiala. Il materiale spugna morbida riduce anche le lesioni causate dai Flugs più solide. </li><li> Mosche sul Power Tower sono memorizzati ed esercitato in fiale contenenti 5 ml di cibo, che fornisce loro un atterraggio più morbido di mosche che sono esercitate in flaconi vuoti. La cucina è tipicamente composto da 10% di saccarosio, 10% lievito, e il 2% agar in acqua, anche se non osserviamo le mosche da mangiare spesso durante il corso di una sessione di allenamento. Se flaconi vuoti vengono utilizzati durante l&#39;addestramento, la percentuale di mosche che subiscono lesioni è aumentato drammaticamente. </li><li> La torre di alimentazione viene utilizzato in un ambiente a temperatura controllata che viene mantenuta a 25 ° C. Mosche sperimentali sono immessi sul Power Tower e fatto salire. Mosche di controllo sono anche posto sulla Torre Power, ma il tappo spugna è pushed giù nella fiala circa 3 mm sopra le mosche al fine di limitare il movimento. Questo gruppo serve come controllo per gli effetti del Power Tower che non sono correlate ad esercitare. Anche se esiste ancora un certo margine di queste mosche di manovra, abbiamo ripetutamente osservato che le mosche in queste condizioni correre molto poco e non dimostrano una risposta fisiologica di esercitare. Può anche essere desiderabile includere un ulteriore gruppo di controllo che non viene immesso sul Power Tower affatto. </li><li> Mosche sono esercitate cinque giorni consecutivi ogni settimana, utilizzando un programma rampa (Figura 2). Durante una settimana le mosche sono esercitati per 2 ore per ogni sessione, due alla settimana per 2,5 ore per sessione, e tre settimane per 3 ore per sessione. Anche se gli altri regimi sono stati testati, questo protocollo produce risultati coerenti tra genotipi e in condizioni divergenti. Questo protocollo è tuttavia soggetto a una vasta gamma di possibili variazioni che potrebbero soddisfare un particolare esperimento. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. Esercizio e fatica Locomotore <ol><li> Tempo di stanchezza durante l&#39;esercizio fisico di resistenza è un utile indicatore fisiologico per confermare e / o di quantificare la capacità di esercizio di una coorte dato. Saggi di fatica può essere eseguita longitudinalmente su coorti che verranno utilizzati in esperimenti di formazione. I saggi possono essere effettuate prima della formazione, dopo il completamento del protocollo di allenamento, o entrambi. Gli altri punti temporali intermedi può essere aggiunto se tracciare il progresso incrementale durante l&#39;allenamento si desidera. Il dosaggio fatica può anche essere usato per misurare la resistenza fisica come risposta a trattamenti diversi dal protocollo di addestramento, come alterazione dieta (Figura 3B). </li><li> Test di fatica deve essere condotto su un giorno in cui la formazione non sta avvenendo. Mosche Sia il sperimentali e di controllo sono posizionati sulla Torre Potenza in fiale da 20 ciascuno e fatto salire fino affaticato. La fatica viene riconosciuta come la mancata risposta a uno stimolo negativo geotassi con l&#39;arrampicata essereportamento. Comportamento a fatica è segnato da osservazione visiva. </li><li> Un flaconcino di mosche viene considerato &quot;affaticato&quot; quando 5 o meno mosche sono in grado di salire più in alto di 2 pollici per quattro gocce consecutivi. Fiale affaticati vengono rimossi dal Power Tower mentre è ancora in funzione, e il tempo di rimozione viene registrato. Tempi di rimozione può essere tracciata come un istogramma nidificato, o come un complotto &quot;time-to-fallimento&quot;. Un esempio di dati tracciati come un complotto &quot;time-to-fallimento&quot; è mostrato in figura 3B. </li><li> I flaconi sono monitorati a intervalli di 10 minuti per un massimo di 10 ore (Figura 3B). </li></ol> 4. Esercizio, età e Locomotore Ability <ol><li> Dal momento che questo protocollo di allenamento si basa su comportamenti indotti da corsa, un test primario per la quantificazione degli effetti della formazione è quello di misurare longitudinalmente il cambiamento, in media, velocità di esecuzione durante l&#39;allenamento. Durante il corso di formazione, 120-fly coorti di mosche esercitato e non esercitate sono testati quotidianamente per la loro risposta ad una s geotassi negativotimulus. La tecnica descritta in ANELLO Gargano et al. (2005) viene utilizzato per misurare la capacità scalata delle mosche 12. In breve, questa tecnica di misura altezza media salita da una fiala di mosche in un tempo definito dopo l&#39;induzione di geotassi negativi. L&#39;altezza scalato durante un tempo definito è equivalente alla velocità arrampicata. Le misure vengono effettuate prima di mettere le mosche sulla macchina per l&#39;allenamento quotidiano in modo da evitare complicazioni dalla fatica dopo l&#39;esecuzione del giorno. </li><li> Nel nostro protocollo standard, le mosche sono esercitati per un totale di tre settimane e la capacità di arrampicata viene esaminato per un totale di cinque settimane: tre settimane durante l&#39;attività di formazione e due settimane dopo l&#39;interruzione di esercizio (Figura 2). Ciò permette di tracciare lo sperimentatore se gli effetti dell&#39;esercizio fisico sulla mobilità persistono anche dopo la cessazione del programma. </li><li> Quattro fotografie di prestazioni ANELLO giornaliero di ogni coorte sono utilizzati per l&#39;analisi delle capacità di arrampicata. Sei flaconi sono inclusi in ogni fotografia. Negative geotaxis viene indotta, e utilizzando una fotocamera temporizzato, una fotografia viene presa dopo un determinato numero di secondi. Usiamo tipicamente due secondi, anche se questo può essere variato a seconda delle condizioni sperimentali. Per ogni fotografia, ogni flacone è diviso in quattro quadranti di eguale altezza, e software di elaborazione immagine viene utilizzato per assegnare ad ogni volo un punteggio basato sul quadrante ha raggiunto entro il periodo di tempo assegnato. Le mosche che si arrampicano per ricevere il quadrante più in alto un punteggio di 4, vola nel quadrante successivo più alto riceverà un 3, vola nel quadrante secondo più alto riceverà un 2, e vola a più basso riceverà un quadrante 1. Le mosche che non salgono fuori del fondo a tutti viene dato un punteggio di 0. </li><li> Per ogni flacone in una fotografia data, un &quot;indice di climbing&quot; è generato dalla media dei punteggi di tutte le mosche in quel flacone. Ogni flaconcino di indici dei quattro fotografie vengono poi conglobati a dare un indice finale di arrampicata per quel giorno. </li><li> Tutti gli esperimenti sono condotti geotassi negativi longitudinaledinally. I risultati sono normalizzati per il punteggio iniziale &quot;pre-esercizio&quot; al fine di ridurre l&#39;effetto della variazione coorte in arrampicata capacità ed evidenziare la variazione relativa longitudinale della capacità arrampicata una coorte come risultato di allenamento. Il punteggio iniziale è determinato dalla media degli indici arrampicata i primi tre giorni e viene assegnato un valore di 1. Studi successivi vengono quindi espressi come percentuale dell&#39;indice iniziale. </li></ol> 5. Risultati rappresentativi Wild-type mosche rispondere ad un protocollo di resistenza con un minore riduzione correlata all&#39;età nella scalata capacità che persiste dopo la fine della formazione, che si riflette nei saggi ANELLO longitudinali in cinque settimane di età (Figura 3A). Questo declino ritardato in geotassi negativi è una risposta standard fenotipica che può servire come controllo positivo per assicurare che wild-type di risposta esercizio sta avvenendo normalmente. Questo insieme di dati viene presentato come un esempio di come l&#39;induzione di esercizio dal programma torre di alimentazione può essere utilizzato come ingresso comportamentale. La capacità di vari fattori genetici o ambientali per modulare questo effetto può essere valutato. Viceversa, la torre di alimentazione può anche essere utilizzato come uscita in vari modelli sperimentali. Ad esempio, genotipo, la dieta, o altre condizioni possono essere variati. Quindi, l&#39;effetto di queste variazioni su fisiologia possono essere testati con la torre di alimentazione. Qui vi mostriamo un esempio di questo approccio. Quando vola con una percentuale variabile di saccarosio nelle loro diete sono stati testati per il tempo di affaticamento, aumento del contenuto di saccarosio correlata con maggiore capacità di resistenza (Figura 3B). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3786/3786fig1.jpg" /> Figura 1. Funzionamento del Power Tower. (AC) Il braccio piegato rullo motorizzato con annesso ruota in senso orario fino ad entrare in contatto con il tubo piegato quadrato. (D, E) Labraccio spinge verso il basso sul tubo piegato quadrato, provocando la piattaforma che è carica di fiale di mosche a sollevare. (F) Poiché il braccio cancella il tubo è consentita la piattaforma di ricadere, costringendo le mosche per tornare al fondo del flaconcino. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3786/3786fig2.jpg" /> Figura 2. Consigliato protocollo di esercizio. Vola sottoposti al protocollo di allenamento sono fatti di esercitare per cinque giorni alla settimana, nel quadro di un regime di tre settimane lunga rampa che aumenta progressivamente la durata di esercizio dagli iniziali 2 ore di 30 minuti ogni settimana. Analisi standard includono test di fatica prima e dopo il programma di esercizi e test ANELLO dalla settimana 1 alla settimana 5. Tutti i saggi vengono eseguiti in duplicato su un numero uguale di mosche esercitate come controllo negativo. Altri vari test fisiologici o biochimici può essere condotto come determinato dal ricercatore. <img alt = &quot;Figura 3&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/3786/3786fig3.jpg&quot; /&gt; Figura 3. Esercizio di resistenza altera molteplici aspetti della mobilità. (A) saggi ANELLO eseguita longitudinalmente attraverso le età in una coppia di sesso maschile Y 1 W 67C23 coorti. Di pari età, geneticamente identiche di controllo esercitato e mosche non esercitati sono stati misurati tutti i giorni per la velocità media di arrampicata. I risultati sono espressi in termini di un indice di arrampicata che è normalizzata all&#39;altezza media salendo attraverso i primi tre giorni di misurazione. Esercizio addestrati mosche mostrato una diminuita declino relativo all&#39;età nella capacità geotassi negativo rispetto ai pari età fratelli non esercitati attraverso le età (2-way ANOVA, p &lt;0,005). (B) test di fatica condotte per 8 ore pari età femminile Canton S mosche mostrano un effetto significativo del tenore di saccarosio nella dieta in tempo per la fatica (Log-rank, p &lt;0,0001). Prima di sperimentare, le mosche sono stati alimentati con un lievito / saccarosio / agar dieta, con il 10% in peso / volume yeast concentrazione e una percentuale variabile di saccarosio nella dieta. Cinque fiale di 20 mosche ciascuno sono stati testati per ogni dieta. Il grafico mostra il numero di fiale ancora cinque o più mosche in esecuzione in un punto determinato momento. Questi risultati possono essere trattate statisticamente e graficamente come una sopravvivenza (o tempo di guasto) curva, con &quot;guasto&quot; per un flacone definito come un momento in cui meno di cinque mosche continuano a rispondere a stimoli geotassi negativo. Si noti che molti altri disegni di studio possibili e dei trattamenti statistici sono possibili, e il trattamento dei dati e di valutazione devono essere adattata per soddisfare scopi individuali.

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W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+iterative+negative+geotaxis+(RING):+a+new+method+for+assessing+age-related+locomotor+decline+in+Drosophila.">Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila.</a> Exp Gerontol. 40, 386-395 (2005).</li></ol>

Non ho nulla da rivelare.

Il protocollo generale qui presentato è riuscita a documentare gli effetti fisiologici dopo l&#39;allenamento. Tuttavia, diverse aree di questo protocollo sono soggetti a modifiche per soddisfare particolari esigenze sperimentali. Ad esempio, la lunghezza di formazione e il numero di attacchi potrebbe essere variata per rendere il programma più o meno impegnativo, come desiderato. L&#39;altezza del contenitore in cui viene misurata la capacità geotassi negativa potrebbe essere modificato per aumentare l&#39;area disponibile per il miglioramento essere documentata. Vari metodi di automatizzare quantificazione di salita velocità può anche essere applicabile. In linea di principio, qualsiasi programma software in grado di distinguere una mosca da sfondo può essere utilizzato per accelerare la raccolta dei dati di processo. Alcuni aspetti del protocollo deve essere modificato solo con grande cautela, però. Ad esempio, esperimenti preliminari indicano fortemente che almeno un giorno di riposo a settimana tende a favorire una maggiore improvement di incessante esercizio quotidiano. Inoltre, i ritmi circadiani e la temperatura sono noti per influenzare il movimento di animali a sangue freddo. Il momento della giornata che la formazione si svolge può essere variata, ma deve sempre essere coerenti all&#39;interno di particolari gruppi a confronto, al fine di evitare la possibilità di effetti confondenti di ritmi circadiani. Il controllo della temperatura è essenziale, e si consiglia una sala dedicata a temperatura costante di attrezzature da palestra a casa. Infine, maschi e femmine devono essere allevati e misurato separatamente, al fine di evitare il potenziale di effetti confondenti delle differenze di fertilità e del sesso in capacità di esercizio. Le potenziali applicazioni di questa metodologia sono limitate solo dalla fantasia del ricercatore. Nel lavoro preliminare, abbiamo utilizzato questa metodologia in tre applicazioni principali: <ol><li> Per misurare l&#39;effetto di esercizio di resistenza su vari aspetti della biologia di tipo selvatico in tutta le età. </li><li> TO misurare l&#39;effetto di esercizio di resistenza su specifici fenotipi mutanti. </li><li> Per lo screening per i fattori genetici che sono necessarie per eseguire i benefici dell&#39;attività fisica </li></ol> Ciascuna di queste applicazioni comprendono un&#39;ampia varietà di possibilità specifiche. Sulla base della nostra esperienza preliminare, fenotipi mutanti tendono a variare con il livello di esercizio fisico, per quanto essi variano con la dieta. L&#39;uso di modelli di invertebrati per capire meglio la relazione tra dieta, esercizio fisico, e la fisiologia dell&#39;invecchiamento è forse l&#39;applicazione più importante generale di questo protocollo.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> Dayton Motoriduttore </td><td> Grainger </td><td> 1LRA6A </td><td></td></tr><tr><td> Raco scatola elettrica </td><td> Grainger </td><td> 5A052 </td><td></td></tr><tr><td> Raco copertina </td><td> Grainger </td><td> 5A053 </td><td></td></tr><tr><td> Cooper Bussmann Fuse </td><td> Grainger </td><td> 6F043 </td><td></td></tr><tr><td> Cooper Bussmann Portafusibile </td><td> Grainger </td><td> 1DD33 </td><td></td></tr><tr><td> Carling Technologies Interruttore </td><td> Grainger </td><td> 2X464 </td><td></td></tr><tr><td> Dayton Control, AC / DC Velocità </td><td> Grainger </td><td> 4X796 </td><td&gt; </td></tr><tr><td> Flugs per stretti flaconi di plastica </td><td> Genesee Scientific </td><td> 49-102 </td><td></td></tr></tbody></table>

endurance training protocol and longitudinal performance assays for drosophila melanogaster

Uno dei problemi più urgenti moderni ricercatori medici è l&#39;impennata dei livelli di obesità, con il conseguente aumento della patologie associate come il diabete e le malattie cardiovascolari 1-3. Un tema importante della ricerca in questi problemi di salute associati riguarda il ruolo di esercizio di resistenza come un intervento benefico. L&#39;esercizio fisico è un poco costoso, non invasivo l&#39;intervento con diversi risultati positivi, come la riduzione in grasso corporeo in eccesso 4, aumento della sensibilità all&#39;insulina nel muscolo scheletrico 5, ha aumentato le risposte anti-infiammatorie e antiossidanti 6, e una migliore capacità contrattile in cardiomiociti 7. Esercizio a bassa intensità è noto per aumentare l&#39;attività e la biogenesi mitocondriale 8 nell&#39;uomo e nel topo, con la coattivatore trascrizionale PGC1-α come un importante intermedio 9,10. Despite l&#39;importanza dell&#39;attività fisica come strumento di lotta contro alcune importanti malattie legate all&#39;età, ampi studi longitudinali genetici sono stati impediti dalla mancanza di un protocollo di allenamento di resistenza per una breve specie modello genetico. La varietà di strumenti genetici disponibili per l&#39;uso con Drosophila, insieme ai suo mantenimento vita breve e poco costoso, ne fanno un modello attraente per un ulteriore studio di questi meccanismi genetici. Con questo in mente abbiamo sviluppato un apparecchio innovativo, conosciuta come la Power Tower, su larga scala di allenamento all&#39;esercizio in Drosophila melanogaster 11. Il Power Tower utilizza comportamento istintivo dei moscerini geotassi negative per indurre ripetutamente arrampicata rapido. Ogni volta che gli impianti di risalita della macchina, poi scende, la piattaforma delle mosche, le mosche sono indotti a salire. Mosche continuano a rispondere finché la macchina è in funzione o fino a diventare troppo affaticato per rispondere. Quindi, il ricercatore può utilizzare la macchina per fornire sformazione imultaneous un gran numero di mosche di pari età e geneticamente identici. Inoltre, si descrivono i saggi associati utili per monitorare i progressi longitudinale di coorte mosca durante l&#39;allenamento.

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Endurance Training Protocol and Longitudinal Performance Assays for Drosophila melanogaster

Descriviamo il primo protocollo allenamento di resistenza per una specie importante modello genetico,<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt;, E delineare alcuni saggi di tracciare i miglioramenti in materia di formazione alla mobilità seguente.

Endurance Training protocollo e saggi prestazioni longitudinali per Drosophila melanogaster

One of the most pressing problems facing modern medical researchers is the surging levels of obesity, with the consequent increase in associated disorders ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Endurance Training Protocol and Longitudinal Performance Assays for Drosophila melanogaster

15.5K Views.  University of Michigan Medical School. Descriviamo il primo protocollo allenamento di resistenza per una specie importante modello genetico, Drosophila melanogaster, E delineare alcuni saggi di tracciare i miglioramenti in materia di formazione alla mobilità seguente.

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High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field. Studying locomotor behavior in Drosophila melanogaster relies on the ability to be able to quantify changes in motion during or in response to a given task. For this reason, a high-resolution video tracking system, such as the one we describe in this paper, is a valuable tool for measuring locomotion in real-time. Our protocol involves the use of an initial air pulse to break the flies momentum, followed by a thirty second filming period in a square chamber. A tracking program is then used to calculate the instantaneous speed of each fly within the chamber in 10 msec increments. Analysis software then compiles this data, and outputs a variety of parameters such as average speed, max speed, time spent in motion, acceleration, etc. This protocol will discuss proper feeding and management of flies for behavioral tasks, handling flies without anesthetization or immobilization, setting up a controlled environment, and running the assay from start to finish.

The study of complex locomotor behavior in Drosophila melanogaster is dependent upon the ability to quantify changes in a given fly's movement. This article demonstrates how to do this using a high-resolution tracking system.

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Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo for studying mitosis1. Drosophila has useful genetics with a sequenced genome, and it can be easily maintained and manipulated. Many mitotic mutants exist, and transgenic flies expressing functional fluorescently (e.g. GFP) - tagged mitotic proteins have been and are being generated. Targeted gene expression is possible using the GAL4/UAS system2. 

The Drosophila early embryo carries out multiple mitoses very rapidly (cell cycle duration, &asymp;10 min). It is well suited for imaging mitosis, because during cycles 10-13, nuclei divide rapidly and synchronously without intervening cytokinesis at the surface of the embryo in a single monolayer just underneath the cortex. These rapidly dividing nuclei probably use the same mitotic machinery as other cells, but they are optimized for speed; the checkpoint is generally believed to not be stringent, allowing the study of mitotic proteins whose absence would cause cell cycle arrest in cells with a strong checkpoint. Embryos expressing GFP labeled proteins or microinjected with fluorescently labeled proteins can be easily imaged to follow live dynamics (Fig. 1). In addition, embryos can be microinjected with function-blocking antibodies or inhibitors of specific proteins to study the effect of the loss or perturbation of their function3. These reagents can diffuse throughout the embryo, reaching many spindles to produce a gradient of concentration of inhibitor, which in turn results in a gradient of defects comparable to an allelic series of mutants. Ideally, if the target protein is fluorescently labeled, the gradient of inhibition can be directly visualized4. It is assumed that the strongest phenotype is comparable to the null phenotype, although it is hard to formally exclude the possibility that the antibodies may have dominant effects in rare instances, so rigorous controls and cautious interpretation must be applied. Further away from the injection site, protein function is only partially lost allowing other functions of the target protein to become evident.

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of microinjection and high resolution imaging in the Drosophila melanogaster syncytial embryo to study mitosis.

Tecniche di microiniezione per Studiare Mitosi in Drosophila melanogaster Embryo sinciziale

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained and restrained whole larvae. For direct control of the environment around the heart another approach utilizes the dissected larvae and removal of the internal organs in order to bathe the heart in desired compounds. The exposed heart also allows membrane potentials to be monitored which can give insight of the ionic currents generated by the myocytes and for electrical conduction along the heart tube. These approaches have various advantages and disadvantages for future experiments that are discussed. The larval heart preparation provides an additional model besides the Drosophila skeletal NMJ to investigate the role of intracellular calcium regulation on cellular function. Learning more about the underlying ionic currents that shape the action potentials in myocytes in various species, one can hope to get a handle on the known ionic dysfunctions associated to specific genes responsible for various diseases in mammals.

Monitoring Heart Function in Larval Drosophila melanogaster for Physiological Studies

We present various ways to monitor heart function in the larva of Drosophila for assessing questions dealing with the function of gap junctions, ion channel mutations, modulation of pacemaker activity and pharmacological studies.

Il monitoraggio delle funzioni cardiaca in larvali Drosophila melanogaster Per gli Studi fisiologici

We present various methods to record cardiac function in the larval Drosophila. The approaches allow heart rate to be measured in unrestrained  and  ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

Immagini dal vivo di Drosophila melanogaster Migrazioni Hemocyte embrionali

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides protection against desiccation and other environmental challenges. Several of these cuticular hydrocarbon (CHC) compounds also function as semiochemical signals, and as such mediate pheromonal communications between members of the same species, or in some instances between different species, and influence behavior. Specialized cells referred to as oenocytes are regarded as the primary site for CHC synthesis. However, relatively little is known regarding the involvement of the oenocytes in the regulation of the biosynthetic, transport, and deposition pathways contributing to CHC output. Given the significant role that CHCs play in several aspects of insect biology, including chemical communication, desiccation resistance, and immunity, it is important to gain a greater understanding of the molecular and genetic regulation of CHC production within these specialized cells. The adult oenocytes of D. melanogaster are located within the abdominal integument, and are metamerically arrayed in ribbon-like clusters radiating along the inner cuticular surface of each abdominal segment. In this video article we demonstrate a dissection technique used for the preparation of oenocytes from adult D. melanogaster. Specifically, we provide a detailed step-by-step demonstration of (1) how to fillet prepare an adult Drosophila abdomen, (2) how to identify the oenocytes and discern them from other tissues, and (3) how to remove intact oenocyte clusters from the abdominal integument. A brief experimental illustration of how this preparation can be used to examine the expression of genes involved in hydrocarbon synthesis is included. The dissected preparation demonstrated herein will allow for the detailed molecular and genetic analysis of oenocyte function in the adult fruit fly.

Dissection of Oenocytes from Adult Drosophila melanogaster

In insects, the oenocytes produce cuticular hydrocarbon compounds. These compounds protect against desiccation and facilitate chemical communication. Here we demonstrate a dissection technique used to isolate the oenocytes from adult Drosophila melanogaster, and illustrate how this preparation can be utilized to study genes involved in hydrocarbon synthesis.

Dissezione di Oenocytes da adulti Drosophila melanogaster</em

In Drosophila melanogaster, as in other insects, a waxy layer on the outer surface of the cuticle, composed primarily of hydrocarbon compounds, provides ...

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline interactions. Testes are typically isolated from adult males 0-3 days after eclosion from the pupal case. The testes of wild-type flies are easily distinguished from other tissues because they are yellow, but the testes of white mutant flies, a common genetic background for laboratory experiments are similar in both shape and color to the fly gut. Performing dissection on a glass microscope slide with a black background makes identifying the testes considerably easier. Testes are removed from the flies using dissecting needles. Compared to protocols that use forceps for testes dissection, our method is far quicker, allowing a well-practiced individual to dissect testes from 200-300 wild-type flies per hour, yielding 400-600 testes. Testes from white flies or from mutants that reduce testes size are harder to dissect and typically yield 200-400 testes per hour.

Isolation of Drosophila melanogaster Testes

Drosophila melanogaster testes can be rapidly and efficiently isolated from adult males using dissecting needles. With practice, one can readily isolate in one or two days an amount of testes sufficient for the analysis of DNA or RNA by high throughput sequencing or more traditional molecular biology methods or of protein for antibody- or enzyme-based assays.

Isolamento di Drosophila melanogaster Testicoli

The testes of Drosophila melanogaster provide an important model for the study of stem cell maintenance and differentiation, meiosis, and soma-germline ...

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element (CRE) Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE possesses an arrangement of binding sites for several transcription factor proteins that confer a regulatory logic specifying when, where, and at what level the regulated gene(s) is expressed. The full set of CREs within an animal genome encodes the organism&prime;s program for development1, and empirical as well as theoretical studies indicate that mutations in CREs played a prominent role in morphological evolution2-4. Moreover, human genome wide association studies indicate that genetic variation in CREs contribute substantially to phenotypic variation5,6. Thus, understanding regulatory logic and how mutations affect such logic is a central goal of genetics. 
Reporter transgenes provide a powerful method to study the in vivo function of CREs. Here a known or suspected CRE sequence is coupled to heterologous promoter and coding sequences for a reporter gene encoding an easily observable protein product. When a reporter transgene is inserted into a host organism, the CRE&prime;s activity becomes visible in the form of the encoded reporter protein. P-element mediated transgenesis in the fruit fly species Drosophila (D.) melanogaster7 has been used for decades to introduce reporter transgenes into this model organism, though the genomic placement of transgenes is random. Hence, reporter gene activity is strongly influenced by the local chromatin and gene environment, limiting CRE comparisons to being qualitative. In recent years, the phiC31 based integration system was adapted for use in D. melanogaster to insert transgenes into specific genome landing sites8-10. This capability has made the quantitative measurement of gene and, relevant here, CRE activity11-13 feasible. The production of transgenic fruit flies can be outsourced, including phiC31-based integration, eliminating the need to purchase expensive equipment and/or have proficiency at specialized transgene injection protocols. 
Here, we present a general protocol to quantitatively evaluate a CRE&prime;s activity, and show how this approach can be used to measure the effects of an introduced mutation on a CRE&prime;s activity and to compare the activities of orthologous CREs. Although the examples given are for a CRE active during fruit fly metamorphosis, the approach can be applied to other developmental stages, fruit fly species, or model organisms. Ultimately, a more widespread use of this approach to study CREs should advance an understanding of regulatory logic and how logic can vary and evolve.

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element CRE Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Phenotypic variation for traits can result from mutations in cis-regulatory element (CRE) sequences that control gene expression patterns. Methods derived for use in Drosophila melanogaster can quantitatively compare the levels of spatial and temporal patterns of gene expression mediated by modified or naturally occurring CRE variants.

Confronto quantitativo di Cis-Regulatory Element (CRE) Attività in transgenici Drosophila melanogaster</em

Gene expression patterns are specified by cis-regulatory element (CRE) sequences, which are also called enhancers or cis-regulatory modules. A typical CRE ...

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced physical performance and increased risk of disease. Individual aging is manifest at the population level as an increase in age-dependent mortality, which is often measured in the laboratory by observing lifespan in large cohorts of age-matched individuals. Experiments that seek to quantify the extent to which genetic or environmental manipulations impact lifespan in simple model organisms have been remarkably successful for understanding the aspects of aging that are conserved across taxa and for inspiring new strategies for extending lifespan and preventing age-associated disease in mammals.
The vinegar fly, Drosophila melanogaster, is an attractive model organism for studying the mechanisms of aging due to its relatively short lifespan, convenient husbandry, and facile genetics. However, demographic measures of aging, including age-specific survival and mortality, are extraordinarily susceptible to even minor variations in experimental design and environment, and the maintenance of strict laboratory practices for the duration of aging experiments is required. These considerations, together with the need to practice careful control of genetic background, are essential for generating robust measurements. Indeed, there are many notable controversies surrounding inference from longevity experiments in yeast, worms, flies and mice that have been traced to environmental or genetic artifacts1-4. In this protocol, we describe a set of procedures that have been optimized over many years of measuring longevity in Drosophila using laboratory vials. We also describe the use of the dLife software, which was developed by our laboratory and is available for download (<a href="http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software">http://sitemaker.umich.edu/pletcherlab/software</a>). dLife accelerates throughput and promotes good practices by incorporating optimal experimental design, simplifying fly handling and data collection, and standardizing data analysis. We will also discuss the many potential pitfalls in the design, collection, and interpretation of lifespan data, and we provide steps to avoid these dangers.

Measurement of Lifespan in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is a powerful model organism for exploring the molecular basis of longevity regulation. This protocol will discuss the steps involved in generating a reproducible, population-based measurement of longevity as well as potential pitfalls and how to avoid them.

Misura della durata della vita in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aging is a phenomenon that results in steady physiological deterioration in nearly all organisms in which it has been examined, leading to reduced ...

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life cycle of Drosophila enables collection of large quantities of material from embryos, larvae, pupae and adult flies, in a synchronized way, at a low economic cost. A major strategy for propagating large numbers of flies is the use of a fly population cage. This useful and common tool in the Drososphila community is an efficient way to regularly produce milligrams to tens of grams of embryos, depending on uniformity of developmental stage desired. While a population cage can be time consuming to set up, maintaining a cage over months takes much less time and enables rapid collection of biological material in a short period. This paper describes a detailed and flexible protocol for the maintenance of a Drosophila melanogaster population cage, starting with 1.5 g of harvested material from the previous cycle.

Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage

This manuscript reports a detailed protocol for culturing, on a regular basis, a population of Drosophila melanogaster using a fly population cage.

Mantenimento di un<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Cage Popolazione

Large quantities of DNA, RNA, proteins and other cellular components are often required for biochemistry and molecular biology experiments. The short life ...