Gli autori desiderano ringraziare il laboratorio del Prof. Anthony Windebank per condividere le loro competenze in materia di DRG dissezione e la cultura, così come il Prof. Chen Shaochen per le discussioni utili per quanto riguarda la configurazione DMD. Questa ricerca è stata finanziata in parte da Tulane University e sovvenzioni da parte del Consiglio Louisiana of Regents (LEQSF [2009-10]-RD-A-18) e il NIH (NS065374).

1. DMD installazione <ol><li> La scheda DMD, guida di luce UV (con collimatore) e la lente obiettivo 4x sono tutti montati verticalmente su un tavolo isolamento dalle vibrazioni. </li><li> La guida ai raggi UV deve essere regolata in modo che la luce colpisce l&#39;array specchio con un angolo di 45 ° rispetto al piano degli specchi, e 24 ° sotto il piano degli specchi (Figura 1). </li><li> La lente obiettivo è montato in modo che la distanza dalla DMD alla lente obiettivo corrisponde alla lunghezza focale associata con la lente. </li><li> Un microscopio invertito è posto sotto la lente dell&#39;obiettivo, in modo che la luce focalizzata riflessa dalla DMD possono essere visualizzati attraverso il microscopio. La distanza dalla lente obiettivo alla superficie polimerizzazione dovrebbe corrispondere a circa la distanza di lavoro della lente. Il palco sul microscopio può quindi essere usato per regolare questa distanza a fuoco con precisione l&#39;immagine. Questa distanza può variare a seconda della superficie polimerizzazione scelto. </li></ol> 2. Costruisce Hydrogel doppio per Tissue Culture Espianto A. DRG espianto adesione <ol><li> Rivestire le pareti di 6-cell e inserti rivestiti cultura collagene (Corning) con Rain-X, avendo cura di evitare la membrana stessa. (In alternativa, una penna barriera idrofoba può essere utilizzato.) </li><li> Inserti idrato durante la notte con 1,5 ml di adesione medio in un incubatore a 37 ° C e 5% di CO 2. L&#39;adesione media è di media neurobasal con il 10% di siero fetale bovino, 1% di penicillina / streptomicina, 0.5mm L-glutamina, e 20 mg / ml di NGF. </li><li> Harvest embrionale radice gangli dorsali (DRG) da E-15 cuccioli di ratto. DRG dovrebbe essere placcato sul collagene rivestito da 6 e inserti, ben quattro per inserto. </li><li> Incubare inserti per 2 ore per consentire DRG adesione alla membrana. </li></ol> B. Dinamica maschera fotopolimerizzazione Un dispositivo micromirror digitale (DMD) è una x 1024 768 serie di singoli specchi, simile a quella di televisori a proiezione, che riflette la luce selettivamente in base alla posizione dello specchio. Per i nostri scopi, il DMD viene usato per modello ultravioletti (UV) su idrogel photocrosslinkable, creando geometrie idrogel determinabile in modo semplice e rapido. La figura 1 mostra la configurazione del percorso DMD e raggi UV. Anche se il nostro DMD è una unità autonoma, il dispositivo può essere integrato anche per l&#39;uso con molti microscopi esistenti. <ol><li> Rimuovere tutto il liquido in eccesso da inserire ed aggiungere 500 ml di polimerizzazione medio dentro l&#39;inserto. Medio di polimerizzazione contiene il 10% PEG (MW 1000) e 0,5% Irgacure 2959 sciolto in media neurobasal integrata con 20 mg / ml di NGF e 1% Pen / Strep. </li><li> Collocare l&#39;inserto sotto il dispositivo DMD su un Rain-X vetrino trattati. </li><li> Caricare l&#39;immagine appropriata in bianco e nero da utilizzare come &quot;fotomaschera&quot; sul DMD, attraverso l&#39;uso del programma incluso ALP-3 GUI di base. Per i nostri scopi, una forma biforcano è stato scelto per consentire l&#39;attuazione di sistemi di guida dei neuriti. </li><li> Utilizzando un microscopio invertito per la visualizzazione, allineare il espianti di tessuto con la posizione appropriata sul fotomaschera utilizzando una sorgente di luce visibile riflessa della DMD. </li><li> Accendere la sorgente di luce visibile per la sorgente di luce UV, e illuminare la soluzione di PEG fino a reticolazione è sufficiente. (Per le condizioni date e 5,0 watt / cm 2 incidente sul DMD, reticolazione può essere completato in appena 55 secondi.) Ripetere per tutti i DRG quattro sull&#39;inserto. </li><li> Lavare ogni inserto tre volte con DPBS sterile e l&#39;1% Pen-Strep. </li><li> Aggiungere 1,5 ml di crescita medio sotto gli inserti di coltura cellulare, e permette di equilibrare in un incubatore per 30 minuti. Mezzo di crescita e &#39;di medie neurobasal contenente 2% B-27, 1% Pen / Strep, 0.5mm L-glutamina, e 20 mg / ml di NGF. </li></ol> C. idrogel secondaria Puramatrix <ol><li> Per le applicazioni neuronale, 1% Puramatrix viene diluita secondo le istruzioni del produttore al 0,15% in sterili H 2 O e integrata con 1 mg / mL laminina solubile. </li><li> Tutti i supporti in eccesso deve essere rimosso dal PEG vuoti, che contengono le espianti DRG, utilizzando un cotton-fioc sterile, Kimwipe, o micropipetta. </li><li> Puramatrix viene aggiunto alla vuoti PEG con una micropipetta per riempire lo spazio vuoto senza traboccare. A seconda del volume vuoto, tipicamente ~ 1 ml viene usato per costruire. </li><li> Puramatrix inizia il processo di auto-assemblaggio immediatamente a contatto con una soluzione salina fisiologica, cioè il PEG gonfio, ma 1,5 mL di terreno di coltura viene aggiunto sotto l&#39;inserto e messo in incubatrice per un&#39;ora per garantire la gelificazione totale. </li><li> Inizialmente, Puramatrix è leggermente acido, in modo da cambiare il supporto dopo un&#39;ora per permettere di equilibrare il pH. </li><li> Cambiamenti media sono necessari circa ogni 48 ore. Fare attenzione che tutti i media èaggiunto sotto l&#39;inserto, per proteggere l&#39;integrità del Puramatrix meccanicamente deboli. </li></ol> Agarosio <ol><li> Per le applicazioni neuronale, agarosio viene diluita ad una soluzione 1% a mezzo di crescita e posto in un bagno d&#39;acqua a 60 ° C fino a quando l&#39;agarosio si scioglie completamente (~ 1 ora). La soluzione è quindi integrata con 1 mg / mL laminina solubile. </li><li> Tutti i supporti in eccesso deve essere rimosso dalla vuoti PEG. </li><li> Agarosio viene aggiunto alla vuoti PEG al fine di riempire lo spazio vuoto senza traboccare. A seconda del volume di vuoto, di solito ~ 1 ml viene usato per costruire. </li><li> 1,5 mL di terreno di coltura è pre-fresco (8 ° C) in un 6-pozzetti, e gli inserti di agarosio contenente vengono trasferiti ai media refrigerati e mantenuti in frigorifero a 8 ° C per almeno tre minuti per consentire di agarosio gel. </li><li> Infine, gli inserti sono trasferiti a 1,5 ml di pre-riscaldato terreno di coltura (37 ° C) e mantenuto in incubatrice a 37 ° C, con cambiamenti supporto richiesto ogni 48 ore. </li></ol> 3. Cellulare dual incapsulamento Hydrogel 3D Incapsulamento idrogel Dual è appropriata quando si utilizza qualsiasi auto-assemblaggio gel. Il gel photocrosslinkable, in questo caso PEG, funge da supporto strutturale per la presentazione geometrica della auto-assemblaggio gel, ad esempio Puramatrix o agarosio. Alcuni dei metodi, in particolare il tipo di gel e la scelta di fotomaschera, dipenderà dalla particolare applicazione desiderata. <ol><li> Caricare una maschera appropriata sul DMD. Per la nostra applicazione, la sopravvivenza cellulare, abbiamo semplicemente scelto una presentazione cilindrica di Puramatrix per aiutare nella stampa delle cellule. Ricercatori che studiano segnalazione cellulare potrebbe essere interessato a una geometria compartimentale per consentire la diffusione di molecole chemiotattici. Inoltre, una rozza approssimazione di un&#39;arteria ha dimostrato di rappresentare possibile applicazione alla ricerca dei vasi sanguigni. </li><li> Trattare le pareti di un inserto in colture cellulari in poliestere con Rain-X, e di luogo in DMD su Rain-X scivolo rivestito. </li><li> Aggiungere 500 l di media polimerizzazione per l&#39;inserto. Indurre reticolazione PEG per esposizione a luce UV per 55 secondi. </li><li> Lavare tre volte con DPBS sterile e l&#39;1% Pen-Strep. </li><li> Rimuovere tutti i supporti in eccesso dal PEG vuoti. </li><li> Spin le cellule alla densità desiderata in un pellet. Bisogna fare attenzione a rimuovere tutti i media dal pellet cellula prima della miscelazione, come Puramatrix inizia auto-assemblaggio immediatamente a contatto con una soluzione salina. Sospendere le cellule all&#39;interno dello 0,15% Puramatrix diluita in H 2 O sterile supplementato con 10% di saccarosio. </li><li> Iniettare il Puramatrix / cellula / saccarosio miscela all&#39;interno vuoti nel PEG. </li><li> Aggiungere 1,5 mL di terreno di crescita sotto l&#39;inserto, e permettono di gel all&#39;interno dell&#39;incubatore per un&#39;ora. </li><li> Cambiare i media dopo un&#39;ora, e ~ ogni 48 ore successive. </li></ol> 4. Singola cella incapsulamento Hydrogel 3D Un incapsulamento idrogel unico potrebbe essere appropriato per ogni situazione in cui le cellule possono essere esaminate all&#39;interno di un idrogel photocrosslinkable. <ol><li> Caricare una maschera appropriata sul DMD. Per gli studi di sopravvivenza cellulare, abbiamo scelto ancora una volta una maschera di base circolare, per rappresentare un cilindro. Maschere simili a quelli mostrati nel metodo 4 potrebbe nuovamente essere applicata per il campo di ricerca appropriato. </li><li> Trattare una cella inserire poliestere cultura con Rain-X, e di luogo in DMD su Rain-X scivolo rivestito. </li><li> Celle in qualsiasi concentrazione desiderata possono essere aggiunti direttamente alla soluzione di PEG al 10%, mescolando bene per assicurare una distribuzione omogenea. </li><li> Aggiungere 500 l di media polimerizzazione per l&#39;inserto. Indurre reticolazione PEG per esposizione a luce UV per 55 secondi. </li><li> Lavare tre volte con DPBS sterile e l&#39;1% Pen-Strep. </li><li> Riempire con mezzo di crescita sia sotto che sopra l&#39;inserto, cambiando ogni ~ 2 giorni. </li></ol> 5. A film sottile di polimerizzazione Hydrogel <ol><li> Caricare una maschera appropriata sul DMD. </li><li> Trattare un collagene rivestito cellule inserire poliestere cultura con Rain-X, e il luogo di pioggia-X scivolo rivestito. </li><li> Aggiungi medio di polimerizzazione sufficiente per coprire solo la parte inferiore dell&#39;inserto (~ 250-300 microlitri per 6-e inserti di lamiera). Consentire ai media di permeare la membrana inserto per 30-45 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere l&#39;eccesso di polimerizzazione medio dal inserto con una micropipetta o Kimwipe. Aggiungere una quantità sufficiente di raggi UV-trasparente di olio per coprire completamente il fondo dell&#39;inserto. Lasciare l&#39;inserto a sedere per 15-30 minuti a temperatura ambiente, il tempo necessario per l&#39;olio per formare uno strato distinto al di sopra della media saturando polimerizzazione della membrana inserimento. </li><li> Collocare l&#39;inserto e far scorrere sotto la DMD. Indurre reticolazione PEG per esposizione a luce UV. A causa della sottigliezza dello strato di PEG, reticolazione può essere completato in appena 15 secondi a 5,0 watt / cm 2 incidente sulla DMD. </li><li&gt; Lavare l&#39;inserto tre volte con DPBS sterile e l&#39;1% Pen-Strep. (Se la persistenza di un residuo oleoso è una preoccupazione, un detergente delicato come il Tween 20 (1%) può essere aggiunta al tampone di lavaggio.) </li><li> Conservare l&#39;inserto in un 6-pozzetti di coltura tissutale. Aggiungi terreno di coltura per cellule in sospensione, nella concentrazione desiderata e pipetta un volume sufficiente di sospensione cellulare dentro l&#39;inserto di coltura cellulare per ottenere la densità cellulare desiderato. Quindi, aggiungere la crescita media abbastanza sotto l&#39;inserto per mantenere completamente la vitalità cellulare (~ 1,5 ml). </li><li> Dopo 48 ore sono trascorse, lavare l&#39;inserto tre volte con DPBS sterile e l&#39;1% Pen-Strep per rimuovere tutte le cellule unadhered. Modificare i media circa una volta ogni 48 ore. </li></ol> 6. Rappresentante Risultati Esempi di idrogel dual costruisce contenenti espianti DRG sono mostrati nella Figura 2. Si noti che la migrazione cellulare e l&#39;estensione dei neuriti è limitata alla regione cellula permissiva del idrogel doppio costrutto. La Figura 3 mostra le cellule incapsulate dissociato allo stesso modo all&#39;interno del costruisce idrogel duale. A causa della natura dinamica del fotomaschera DMD, la geometria a disposizione per l&#39;incapsulamento è limitata solo dalle dimensioni e la risoluzione delle ottiche. Incapsulamento delle cellule è stato possibile anche all&#39;interno di un idrogel singolo photopolymerizable, PEG, e un vivo / morto test di vitalità è stato effettuato, come evidenziato in Figura 4. Incapsulamento di PEG è inteso solo come esempio, come PEG non rappresenta un ambiente ideale per le cellule neurali. Pertanto, la vitalità cellulare realizzato nel nostro costruisce PEG è comprensibilmente bassa. Infine, esempi di utilizzo PEG film sottile come uno strato di fantasia restrittive per l&#39;adesione cellulare su inserti colture cellulari sono mostrati in figura 5. Inoltre, esempi di possibili &quot;cattivi&quot; i risultati sono offerti in Figura 6. I risultati rappresentano solo una piccola frazione dei possibili usi dei metodi sviluppati nel nostro laboratorio. Essi hanno lo scopo di dimostrare l&#39;, versatilità e facilità la vitalità del nostro approccio, e potrebbero essere trattati come &quot;prova di principio&quot; per i ricercatori a sviluppare i loro propri adattamenti possibili. <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Illustrazione schematica del percorso della luce utilizzata per fotolitografia. Riquadro: La luce UV illumina il DMD con un angolo di 45 ° e 24 ° sotto il piano del vettore specchio. <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Crescita e la proliferazione in etichetta DRG contenenti costrutti di idrogel duale. DC) raffigurante immagini polimerizzato costruisce PEG (grigio) con neuriti marcato con beta tubulina III (verde), i nuclei delle cellule DAPI colorati (blu). Il espianti DRG sono contenuti in Puramatrix e situati nelle regioni circolare del modello, con neuriti crescente verso la biforcazione (s). <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Costruisce idrogel doppio contenente cellule marcate con calceina AM, un marker di cellule in vivo, dopo 48 ore in mezzo di crescita. DC) PEG forme diverse, piene di Puramatrix contenenti dissociata neuroni DRG (~ 5x10 3 celle / mL). <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Idrogel singola costruzione contenenti cellule vive etichettati con calceina AM (verde) e le cellule morte etichettati con etidio omodimero-1 (rossa) dopo 24 ore in mezzo di crescita (5x10 3 celle / mL). <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Cella Figura 5. PEG restrittive polimerizzate come un film sottile utilizzando un &quot;modello di prova&quot; per aderire selettivamente le cellule dissociate alla membrana rivestita di collagene di supporti permeabili. A, B) le cellule vive sono etichettati dopo 48 ore con calceina AM (verde), mentre le cellule morte vengono etichettati con etidio omodimero-1 (rossa). Adesione cellulare minima si verifica nella zona contenente il film sottile PEG. <img src="/files/ftp_upload/2636/2636fig6.jpg" alt="Figura 6" /> Figura 6. Immagini rappresentative dei risultati indesiderati. A) polimerizzazione parziale della PEG, portando ad una PEG inutilizzabile costruire. Polimerizzazione improprio può verificarsi a causa della presenza di un menisco nel pre-polimero medio, quantità insufficienti di media polimerizzazione, esposizione ai raggi UV insufficiente o non corretta messa a fuoco delle ottiche. B) immagine raffigurante polimerizzato costruisce PEG (grigio) con neuriti marcato con beta tubulina III (verde), i nuclei delle cellule DAPI colorati (blu). I neuriti sono stati in grado di crescere al di fuori dei canali PEG fantasia. Ciò si verifica spesso nella condizione che trabocca Puramatrix sulla parte superiore della porzione PEG durante l&#39;iniezione.

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Il metodo descritto nel presente documento può essere utilizzato da qualsiasi investigatore alla ricerca semplice e riproducibile sistemi di colture cellulari. Teoricamente, a causa della grande varietà di idrogel photopolymerizable disponibili, l&#39;ambiente potrebbe essere adattato per consentire l&#39;utilizzo con qualsiasi tipo di cellula, compreso espianti di tessuto intero. Inoltre, il sistema duale idrogel permette di migliorare il controllo dello spazio nella presentazione di auto-polimerizzazione idrogel, che tendono a creare forme amorfe da soli. La risultante &quot;2,5 D&quot; costruisce idrogel micropatterned fornire una matrice 3D di crescita neurale presentato in una configurazione 2D che permette conveniente valutazione microscopica. Il substrato su cui si polimerizzato il gel può essere variata, consentendo un maggiore controllo nel disegno sperimentale. I nostri metodi sono ottimizzati per l&#39;uso con supporti colture cellulari permeabili, come abbiamo visto viabilità migliorata (Figura 4) rispetto alla polimerizzazione su vetrini (dati non riportati). Tuttavia, le superfici di polimerizzazione altri possono essere più applicabile per diverse applicazioni: lavorazione su vetro slide utilizzate negli esperimenti di microfluidica o formazioni aggregato di cellule, per esempio. La nostra esperienza con questi sistemi cultura ha portato all&#39;identificazione di potenziali aree di difficoltà. In primo luogo, le tecniche di cura sono tenuti a mantenere la sterilità dei costrutti. A causa della natura ingombrante della configurazione DMD, è difficile operare passi polimerizzazione in condizioni sterili. Per combattere questo problema, il risciacquo passo descritto nei metodi è utile, e gli antibiotici devono essere utilizzati in tutti i media. Inoltre, lo spessore finale e la forma del costrutto polimerizzato è fortemente dipendente dal comportamento fluido del pre-polimero misto, e la presenza di un menisco può portare a costrutti gel che sono troppo sottili o non completamente polimerizzati (Figura 6). A due passi possono essere adottate per minimizzare la formazione di un menisco interno inserisce colture cellulari. Per idrogel di spessore (&gt; 200 micron), un semplice rivestimento di pioggia-X attorno alla parete interna dell&#39;inserto è sufficiente. Tuttavia, come brevemente descritto sopra, per i costrutti sottili (&lt;200 micron), uno strato di olio è necessario per minimizzare sia il menisco e negare tempra ossigeno della polimerizzazione dei radicali liberi. Risoluzione è risultato essere dipendente da spessore, con una diminuzione della dimensione del tratto realizzato con gel sempre più spesso. La risoluzione inoltre varia a seconda che la funzione di rappresentare un rilievo positivo o negativo in idrogel. Tuttavia, abbiamo ottenuto una risoluzione sufficiente per le costruzioni con dimensioni caratteristiche minimo sulla scala di circa 100 micron con obiettivi microscopio solo come messa a fuoco dell&#39;ottica. I nostri esperimenti hanno mostrato che i costrutti idrogel dual qui descritti costituiscono una base eccellente per la formazione di base in vitro modelli di crescita dei neuriti e di orientamento. La tecnica impiegata micropatterning è un adattamento dei metodi esistenti 18,19, ma il nostro set-up ha sottolineato un semplice da implementare la progettazione ed è stato ottimizzato per la produzione di costrutti idrogel duplice inserti colture cellulari; inserti in colture cellulari sono stati di vitale importanza per migliorare la vitalità cellulare e come reticolazione intorno espianti tessuto precedentemente aderente. Il campo di applicazione i risultati mostrati è limitata dagli interessi del nostro laboratorio, tuttavia, riteniamo che i metodi descritti in questa pubblicazione si rivelerà utile per i ricercatori alla ricerca di un relativamente a buon mercato, metodo veloce e facile da usare per la fabbricazione di coltura cellulare 3D modelli.

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		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
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<td>Digital Micromirror Device</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Texas Instruments</td>
<td>DLPD4X00KIT</td>
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<tr>
<td>Collagen Coated Transwell Permeable Support </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>3491</td>
<td>Also referred to as Cell Culture Insert in manuscript</td>
</tr>
<tr>
<td>Polyester Transwell Permable Support</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Corning</td>
<td>3412</td>
<td>Also referred to as Cell Culture Insert in manuscript</td>
</tr>
<tr>
<td>Neurobasal Medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>21103-049</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Fetal Bovine Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>16000-036</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-glutamine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>25030-164</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nerve Growth Factor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>13257-019</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pen/Strep</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>B-27 Supplement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17504-044</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DPBS</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>14190-250</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Puramatrix</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>354250</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PEG 1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Polysciences, Inc.</td>
<td>15178</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Irgacure 2959</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ciba Specialty Chemicals</td>
<td>0298913AB</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Oil</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Have used both canola oil and silicon oil</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Needs to be UV transparent, and minimize +/- meniscus formation</td>
</tr>
<tr>
<td>OmniCure Series 1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Exfo</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rain-X</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

fabrication of micropatterned hydrogels for neural culture systems using dynamic mask projection photolithography

Sempre più spesso, fantasia ambienti colture cellulari stanno diventando una tecnica rilevante per lo studio caratteristiche cellulari, e molti ricercatori credono nella necessità di ambienti 3D per rappresentare gli esperimenti in vitro che meglio imitare in qualità vivo 1-3. Gli studi in campi come la ricerca sul cancro 4, ingegneria neurale 5, fisiologia cardiaca 6 e cellula-matrice interazione 7,8 hanno mostrato il comportamento delle cellule differisce in modo sostanziale tra le colture monostrato tradizionali e costrutti 3D. Idrogel sono utilizzati come ambienti 3D a causa della loro varietà, versatilità e capacità di adattare la composizione molecolare attraverso funzionalizzazione 9-12. Esistono numerose tecniche per la creazione di costrutti come cellule matrici di supporto, tra cui electrospinning 13, francobolli elastomero 14, stampa a getto d&#39;inchiostro 15, photopatterning additivo 16, fotomaschera statico proiezione-litografia 17, e microstereolithography maschera dinamico 18. Purtroppo, questi metodi comportano fasi di produzione multiple e / o attrezzature non facilmente adattabile alle celle convenzionali e metodi di coltura di tessuti. La tecnica impiegata in questo protocollo si adatta ultimi due metodi, utilizzando un dispositivo digitale microspecchi (DMD) per creare fotomaschere dinamico per reticolazione geometricamente specifici poli-(glicole etilenico) (PEG) idrogel, indotta attraverso polimerizzazione UV iniziato radicali liberi. La risultante &quot;2,5 D&quot; strutture offrono un ambiente limitato 3D per la crescita neuronale. Ci avvaliamo di un sistema dual-idrogel approccio, in cui PEG funge da cellula-restrittivo struttura regione fornisce a un altro modo informe, ma cellule permissive auto-assemblaggio gel a base di entrambi i Puramatrix o agarosio. Il processo è veloce semplice fabbricazione passo che è altamente riproducibile e facilmente adattati per essere utilizzati con i metodi tradizionali di coltura cellulare e substrati. Espianti di tessuto intero, come ad esempio embrionale gangli spinali (DRG), possono essere incorporati in costrutti idrogel doppio per le prove sperimentali come crescita dei neuriti. Inoltre, le cellule possono essere dissociate incapsulato nel idrogel photocrosslinkable o auto polimerizzazione, o selettivamente aderito alla membrana permeabile supporto utilizzando cellule restrittive photopatterning. Utilizzando la DMD, abbiamo creato idrogel costruisce fino a ~ 1 mm di spessore, ma a film sottile (&lt;200 micron), le strutture PEG sono stati limitati dalla tempra d&#39;ossigeno della reazione di polimerizzazione radicalica. Successivamente abbiamo sviluppato una tecnica che utilizza uno strato di olio di sopra del liquido di polimerizzazione che ha permesso sottile polimerizzazione struttura PEG. In questo protocollo, si descrive la creazione rapida di sistemi di idrogel 3D per la produzione di microfabbricazione di cellule neuronali e colture di tessuti. I costrutti idrogel dual dimostrato nel presente documento rappresentano versatili modelli in vitro che possono rivelarsi utili per gli studi nel campo delle neuroscienze che coinvolgono la sopravvivenza delle cellule, la migrazione e / o la crescita dei neuriti e di orientamento. Inoltre, come il protocollo può funzionare per molti tipi di idrogel e cellule, le potenziali applicazioni sono sia vario e vasto.

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Fabrication of Micropatterned Hydrogels for Neural Culture Systems using Dynamic Mask Projection Photolithography

Semplici tecniche sono descritte per la produzione rapida di microfabbricazione sistemi di coltura neurali utilizzando un dispositivo digitale micromirror per litografia dinamica proiezione maschera su substrati regolari colture cellulari. Questi sistemi di coltura possono essere più rappresentativo dell&#39;architettura naturale biologico, e le tecniche descritte potrebbe essere adattato per numerose applicazioni.

Fabbricazione di idrogel Micropatterned per i sistemi Cultura neurali utilizzando Dynamic Fotolitografia proiezione Mask

Increasingly, patterned cell culture environments are becoming a relevant technique to study cellular characteristics, and many researchers believe in the ...

fabrication-micropatterned-hydrogels-for-neural-culture-systems-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

18.6K Views.  Tulane University. Semplici tecniche sono descritte per la produzione rapida di microfabbricazione sistemi di coltura neurali utilizzando un dispositivo digitale micromirror per litografia dinamica proiezione maschera su substrati regolari colture cellulari. Questi sistemi di coltura possono essere più rappresentativo dell'architettura naturale biologico, e le tecniche descritte potrebbe essere adattato per numerose applicazioni.

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Microfabricated Platforms for Mechanically Dynamic Cell Culture

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or fundamental cell biology studies is limited by current bioreactor technologies, which cannot simultaneously apply a variety of mechanical stimuli to cultured cells. In order to address this issue, we have developed a series of microfabricated platforms designed to screen for the effects of mechanical stimuli in a high-throughput format. In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and further demonstrate how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

In this protocol, we demonstrate the fabrication of a microactuator array of vertically displaced posts on which the technology is based, and how this base technology can be modified to conduct high-throughput mechanically dynamic cell culture in both two-dimensional and three-dimensional culture paradigms.

Piattaforme microfabbricazione per coltura cellulare meccanicamente dinamica

The ability to systematically probe in vitro cellular response to combinations of mechanobiological stimuli for tissue engineering, drug discovery or ...

Ricerca

Bioingegneria

Alginate Hydrogels for Three-Dimensional Organ Culture of Ovaries and Oviducts

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ovarian cancers is still in question and might be either the ovarian surface epithelium (OSE) or the distal epithelium of the fallopian tube fimbriae2,3. Culturing the normal cells as a primary culture in vitro will enable scientists to model specific changes that might lead to ovarian cancer in the distinct epithelium, thereby definitively determining the cell type of origin. This will allow development of more accurate biomarkers, animal models with tissue-specific gene changes, and better prevention strategies targeted to this disease.
Maintaining normal cells in alginate hydrogels promotes short term in vitro culture of cells in their three-dimensional context and permits introduction of plasmid DNA, siRNA, and small molecules. By culturing organs in pieces that are derived from strategic cuts using a scalpel, several cultures from a single organ can be generated, increasing the number of experiments from a single animal. These cuts model aspects of ovulation leading to proliferation of the OSE, which is associated with ovarian cancer formation. Cell types such as the OSE that do not grow well on plastic surfaces can be cultured using this method and facilitate investigation into normal cellular processes or the earliest events in cancer formation4.
Alginate hydrogels can be used to support the growth of many types of tissues5. Alginate is a linear polysaccharide composed of repeating units of &beta;-D-mannuronic acid and &alpha;-L-guluronic acid that can be crosslinked with calcium ions, resulting in a gentle gelling action that does not damage tissues6,7. Like other three-dimensional cell culture matrices such as Matrigel, alginate provides mechanical support for tissues; however, proteins are not reactive with the alginate matrix, and therefore alginate functions as a synthetic extracellular matrix that does not initiate cell signaling5. The alginate hydrogel floats in standard cell culture medium and supports the architecture of the tissue growth in vitro.
A method is presented for the preparation, separation, and embedding of ovarian and oviductal organ pieces into alginate hydrogels, which can be maintained in culture for up to two weeks. The enzymatic release of cells for analysis of proteins and RNA samples from the organ culture is also described. Finally, the growth of primary cell types is possible without genetic immortalization from mice and permits investigators to use knockout and transgenic mice.

Culture of normal cells in their three-dimensional context represents an alternative method to study early events required for cellular transformation and tumorigenesis. This method is used to grow normal ovarian and oviductal cells to study early events in ovarian cancer formation.

Idrogeli di alginato per tridimensionale Cultura Organo di ovaie e tube

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer deaths in women and has a 63% mortality rate in the United States1. The cell type of origin for ...

Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

The field of human trophoblast research aids in understanding the complex environment established during placentation. Due to the nature of these studies, human in vivo experimentation is impossible. A combination of primary cultures, explant cultures and trophoblast cell lines1 support our understanding of invasion of the uterine wall2 and remodeling of uterine spiral arteries3,4 by extravillous trophoblast cells (EVTs), which is required for successful establishment of pregnancy. Despite the wealth of knowledge gleaned from such models, it is accepted that in vitro cell culture models using EVT-like cell lines display altered cellular properties when compared to their in vivo counterparts5,6. Cells cultured in the rotating cell culture system (RCCS) display morphological, phenotypic, and functional properties of EVT-like cell lines that more closely mimic differentiating in utero EVTs, with increased expression of genes mediating invasion (e.g. matrix metalloproteinases (MMPs)) and trophoblast differentiation7,8,9. The Saint Georges Hospital Placental cell Line-4 (SGHPL-4) (kindly donated by Dr. Guy Whitley and Dr. Judith Cartwright) is an EVT-like cell line that was used for testing in the RCCS.
The design of the RCCS culture vessel is based on the principle that organs and tissues function in a three-dimensional (3-D) environment. Due to the dynamic culture conditions in the vessel, including conditions of physiologically relevant shear, cells grown in three dimensions form aggregates based on natural cellular affinities and differentiate into organotypic tissue-like assemblies10,11,12 . The maintenance of a fluid orbit provides a low-shear, low-turbulence environment similar to conditions found in vivo. Sedimentation of the cultured cells is countered by adjusting the rotation speed of the RCCS to ensure a constant free-fall of cells. Gas exchange occurs through a permeable hydrophobic membrane located on the back of the bioreactor. Like their parental tissue in vivo, RCCS-grown cells are able to respond to chemical and molecular gradients in three dimensions (i.e. at their apical, basal, and lateral surfaces) because they are cultured on the surface of porous microcarrier beads. When grown as two-dimensional monolayers on impermeable surfaces like plastic, cells are deprived of this important communication at their basal surface. Consequently, the spatial constraints imposed by the environment profoundly affect how cells sense and decode signals from the surrounding microenvironment, thus implying an important role for the 3-D milieu13.
We have used the RCCS to engineer biologically meaningful 3-D models of various human epithelial tissues7,14,15,16. Indeed, many previous reports have demonstrated that cells cultured in the RCCS can assume physiologically relevant phenotypes that have not been possible with other models10,17-21. In summary, culture in the RCCS represents an easy, reproducible, high-throughput platform that provides large numbers of differentiated cells that are amenable to a variety of experimental manipulations. 
In the following protocol, using EVTs as an example, we clearly describe the steps required to three-dimensionally culture adherent cells in the RCCS.

Traditional, two dimensional cell culture techniques often result in altered characteristics with respect to differentiation markers, cytokines and growth factors. Three-dimensional cell culture in the rotating cell culture system (RCCS) reestablishes expression of many of these factors as shown here with an extravillous trophoblast cell line.

Rotazione Cultura sistemi cellulari per colture cellulari umane: cellule del trofoblasto umano come modello

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

Cell Co-culture Patterning Using Aqueous Two-phase Systems

Cell patterning technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the future development of high throughput cell assays, platforms for studying cell-cell interactions and tissue engineered systems. This detailed protocol describes a method for generating co-cultures of cells using biocompatible solutions of dextran (DEX) and polyethylene glycol (PEG) that phase-separate when combined above threshold concentrations. Cells can be patterned in a variety of configurations using this method. Cell exclusion patterning can be performed by printing droplets of DEX on a substrate and covering them with a solution of PEG containing cells. The interfacial tension formed between the two polymer solutions causes cells to fall around the outside of the DEX droplet and form a circular clearing that can be used for migration assays. Cell islands can be patterned by dispensing a cell-rich DEX phase into a PEG solution or by covering the DEX droplet with a solution of PEG. Co-cultures can be formed directly by combining cell exclusion with DEX island patterning. These methods are compatible with a variety of liquid handling approaches, including manual micropipetting, and can be used with virtually any adherent cell type.

Aqueous two-phase systems were used to simultaneously pattern multiple populations of cells. This fast and easy method for cell patterning takes advantage of the phase separation of aqueous solutions of dextran and polyethylene glycol and the interfacial tension that exists between the two polymer solutions.

Cella Co-cultura Patterning Uso acquose due sistemi monofase

Cell patterning  technologies that are fast, easy to use and affordable will be required for the  future development of high throughput cell assays, ...

Fabrication and Implantation of Miniature Dual-element Strain Gages for Measuring In Vivo Gastrointestinal Contractions in Rodents.

Gastrointestinal dysfunction remains a major cause of morbidity and mortality. Indeed, gastrointestinal (GI) motility in health and disease remains an area of productive research with over 1,400 published animal studies in just the last 5 years. Numerous techniques have been developed for quantifying smooth muscle activity of the stomach, small intestine, and colon. In vitro and ex vivo techniques offer powerful tools for mechanistic studies of GI function, but outside the context of the integrated systems inherent to an intact organism. Typically, measuring in vivo smooth muscle contractions of the stomach has involved an anesthetized preparation coupled with the introduction of a surgically placed pressure sensor, a static pressure load such as a mildly inflated balloon or by distending the stomach with fluid under barostatically-controlled feedback. Yet many of these approaches present unique disadvantages regarding both the interpretation of results as well as applicability for in vivo use in conscious experimental animal models. The use of dual element strain gages that have been affixed to the serosal surface of the GI tract has offered numerous experimental advantages, which may continue to outweigh the disadvantages. Since these gages are not commercially available, this video presentation provides a detailed, step-by-step guide to the fabrication of the current design of these gages. The strain gage described in this protocol is a design for recording gastric motility in rats. This design has been modified for recording smooth muscle activity along the entire GI tract and requires only subtle variation in the overall fabrication. Representative data from the entire GI tract are included as well as discussion of analysis methods, data interpretation and presentation.

Fabrication and Implantation of Miniature Dual-element Strain Gages for Measuring In Vivo Gastrointestinal Contractions in Rodents.

The in vivo measurement of smooth muscle contractions along the gastrointestinal tract of laboratory animals remains a powerful, though underutilized, technique. Flexible, dual element strain gages are not commercially available and require fabrication. This protocol describes the construction of reliable, inexpensive strain gages for acute or chronic implantation in rodents.

Fabbricazione e impianto di miniatura a doppio elemento Estensimetri per misurazione<em&gt; In Vivo</em&gt; Gastrointestinale Contrazioni nei roditori.

Gastrointestinal dysfunction remains a major cause of morbidity and mortality. Indeed, gastrointestinal (GI) motility in health and disease remains an ...

Gene Transfection toward Spheroid Cells on Micropatterned Culture Plates for Genetically-modified Cell Transplantation

To improve the therapeutic effectiveness of cell transplantation, a transplantation system of genetically modified, injectable spheroids was developed. The cell spheroids are prepared in a culture system on micropatterned plates coated with a thermosensitive polymer. A number of spheroids are formed on the plates, corresponding to the cell adhesion areas of 100 &#181;m diameter that are regularly arrayed in a two-dimensional manner, surrounded by non-adhesive areas that are coated by a polyethylene glycol (PEG) matrix. The spheroids can be easily recovered as a liquid suspension by lowering the temperature of the plates, and their structure is well maintained by passing them through injection needles with a sufficiently large caliber (over 27 G). Genetic modification is achieved by gene transfection using the original non-viral gene carrier, polyplex nanomicelle, which is capable of introducing genes into cells without disrupting the spheroid structure. For primary hepatocyte spheroids transfected with a luciferase-expressing gene, the luciferase is sustainably obtained in transplanted animals, along with preserved hepatocyte function, as indicated by albumin expression. This system can be applied to a variety of cell types including mesenchymal stem cells.

This protocol describes a cell transplantation system using genetically modified, injectable spheroids. Cell spheroids are cultured on micropatterned culture plates and recovered after gene introduction using polyplex nanomicelles. This system facilitates prolonged transgene expression from the transplanted cells in host animals while maintaining the innate function of the cells.

Gene Transfection verso Celle sferoide su lastre micropatterned coltura per trapianto di cellule geneticamente modificati

To improve the therapeutic effectiveness of cell transplantation, a transplantation system of genetically modified, injectable spheroids was developed. ...

Polymeric Microneedle Array Fabrication by Photolithography

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a photomask consisting of embedded micro-lenses. Embedded micro-lenses were found to influence MN geometry (sharpness). Robust MN arrays with tip diameters ranging between 41.5 &#181;m &#177; 8.4 &#181;m and 71.6 &#181;m &#177; 13.7 &#181;m, with two different lengths (1,336 &#181;m &#177; 193 &#181;m and 957 &#181;m &#177; 171 &#181;m) were fabricated. These MN arrays may provide potential applications in delivery of low molecular and macromolecular therapeutic agents through skin.

Here, we present a protocol describing a mold-free fabrication process of the polymeric microneedles by photolithography.

Polimerici Microneedle Array Fabrication per Fotolitografia

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a ...

Microfluidic Genipin Deposition Technique for Extended Culture of Micropatterned Vascular Muscular Thin Films

The chronic nature of vascular disease progression requires the development of experimental techniques that simulate physiologic and pathologic vascular behaviors on disease-relevant time scales. Previously, microcontact printing has been used to fabricate two-dimensional functional arterial mimics through patterning of extracellular matrix protein as guidance cues for tissue organization. Vascular muscular thin films utilized these mimics to assess functional contractility. However, the microcontact printing fabrication technique used typically incorporates hydrophobic PDMS substrates. As the tissue turns over the underlying extracellular matrix, new proteins must undergo a conformational change or denaturing in order to expose hydrophobic amino acid residues to the hydrophobic PDMS surfaces for attachment, resulting in altered matrix protein bioactivity, delamination, and death of the tissues.
Here, we present a microfluidic deposition technique for patterning of the crosslinker compound genipin. Genipin serves as an intermediary between patterned tissues and PDMS substrates, allowing cells to deposit newly-synthesized extracellular matrix protein onto a more hydrophilic surface and remain attached to the PDMS substrates. We also show that extracellular matrix proteins can be patterned directly onto deposited genipin, allowing dictation of engineered tissue structure. Tissues fabricated with this technique show high fidelity in both structural alignment and contractile function of vascular smooth muscle tissue in a vascular muscular thin film model. This technique can be extended using other cell types and provides the framework for future study of chronic tissue- and organ-level functionality.

We present a method for microfluidic deposition of patterned genipin and fibronectin on PDMS substrates, allowing extended viability of vascular smooth muscle cell-dense tissues. This tissue fabrication method is combined with previous vascular muscular thin film technology to measure vascular contractility over disease-relevant time courses.

Microfluidic genipina Deposizione Tecnica per la cultura estesa di micropatterned vascolari muscolari Thin Films

The chronic nature of vascular disease progression requires the development of experimental techniques that simulate physiologic and pathologic vascular ...

Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In particular, light-mediated click reactions, such as photoinitiated thiol&#8722;ene and thiol&#8722;yne reactions, afford spatiotemporal control over material properties and allow the design of systems with a high degree of user-directed property control. Fabrication and modification of hydrogel-based biomaterials using the precision afforded by light and the versatility offered by these thiol&#8722;X photoclick chemistries are of growing interest, particularly for the culture of cells within well-defined, biomimetic microenvironments. Here, we describe methods for the photoencapsulation of cells and subsequent photopatterning of biochemical cues within hydrogel matrices using versatile and modular building blocks polymerized by a thiol&#8722;ene photoclick reaction. Specifically, an approach is presented for constructing hydrogels from allyloxycarbonyl (Alloc)-functionalized peptide crosslinks and pendant peptide moieties and thiol-functionalized poly(ethylene glycol) (PEG) that rapidly polymerize in the presence of lithium acylphosphinate photoinitiator and cytocompatible doses of long wavelength ultraviolet (UV) light. Facile techniques to visualize photopatterning and quantify the concentration of peptides added are described. Additionally, methods are established for encapsulating cells, specifically human mesenchymal stem cells, and determining their viability and activity. While the formation and initial patterning of thiol-alloc hydrogels are shown here, these techniques broadly may be applied to a number of other light and radical-initiated material systems (e.g., thiol-norbornene, thiol-acrylate) to generate patterned substrates.

We describe a sequential process for light-mediated formation and subsequent biochemical patterning of synthetic hydrogel matrices for three-dimensional cell culture applications. The construction and modification of hydrogels with cytocompatible photoclick chemistry is demonstrated. Additionally, facile techniques to quantify and observe patterns and determine cell viability within these hydrogels are presented.

Formazione Light-mediata ed il modello di idrogel per colture cellulari

Click chemistries have been investigated for use in numerous biomaterials applications, including drug delivery, tissue engineering, and cell culture. In ...

Tunable Hydrogels from Pulmonary Extracellular Matrix for 3D Cell Culture

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung tissue from porcine, rat, or mouse, the tissue is perfused and submerged in subsequent chemical detergents to remove the cellular debris. Histological comparison of the tissue before and after processing confirms removal of over 95% of double stranded DNA and alpha galactosidase staining suggests the majority of cellular debris is removed. After decellularization, the tissue is lyophilized and then cryomilled into a powder. The matrix powder is digested for 48 hr in an acidic pepsin digestion solution and then neutralized to form the pregel solution. Gelation of the pregel solution can be induced by incubation at 37 &#176;C and can be used immediately following neutralization or stored at 4 &#176;C for up to two weeks. Coatings can be formed using the pregel solution on a non-treated plate for cell attachment. Cells can be suspended in the pregel prior to self-assembly to achieve a 3D culture, plated on the surface of a formed gel from which the cells can migrate through the scaffold, or plated on the coatings. Alterations to the strategy presented can impact gelation temperature, strength, or protein fragment sizes. Beyond hydrogel formation, the hydrogel stiffness may be increased using genipin.

This is a method to create a 3-dimensional cell culture scaffold from pulmonary extracellular matrix. Intact lung is processed into hydrogels that can support the growth of cells in three-dimensions.

Sintonizzabile idrogel da polmonare matrice extracellulare per colture cellulari 3D

Here we present a method for establishing multiple component cell culture hydrogels for in vitro lung cell culture. Beginning with healthy en bloc lung ...