Ringraziamo Yutian Gan per l&#39;uso della figura 3. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Science Foundation 0420971; la Smith College Blakeslee, Wilens e fondi Holmes, e l&#39;Howard Hughes Medical Institute.

1. Preparazione del campione <ol><li> Usa fresca, tessuto flash RNAlater congelati o trattati dai topi come materiale di partenza. Blot via qualsiasi conservante in eccesso con un Kimwipe prima di procedere. </li><li> Rimuovere tutti i tendini e la fascia intorno al muscolo e tritare il tessuto con singole lame di rasoio taglio per 2 minuti su lastre di vetro freddo in una stanza fredda (4 ° C) fino a quando il tessuto è ben tritato o in polvere. Raccogliere il campione in un pre-pesato provetta da microcentrifuga e determinare il peso del tessuto. Utilizzare non più di 10 mg di tessuto come materiale di partenza. </li><li> Aggiungere 45 microlitri di buffer di estrazione (8 M urea, 50 mM DTT, 4% CHAPS, ampholytes vettore 0,2% 5 / 8, 0,0002% bromofenolo blu) per 1 mg di tessuto macinato, a temperatura ambiente. Se il volume è superiore a 350 microlitri, aggiungere 350 microlitri inizialmente e omogeneizzare (passo 1,4), quindi aggiungere il resto del buffer per ridurre schizzi. </li><li> Omogeneizzare il tessuto sette volte con un pestello motorizzato (Kontes Corp) per 15 secondi a4 ° C, con due minuti di raffreddamento a ghiaccio tra ogni omogeneizzazione. </li><li> Centrifugare i campioni a 15.600 xg per 30 minuti a 4 ° C. Salvare il surnatante e misurare il suo volume. La cella detriti pellet viene scartato. </li><li> Precipitare le proteine ​​del surnatante con gelida grado reagente acetone (3 volte v: rapporto v). Agitare per 15 secondi. Centrifugare per 15.600 xg per 10 secondi per formare pellet, e risospendere in tampone di estrazione con il motore Kontes e bacchette in polipropilene agitazione (Biospec Prod) </li><li> Ripetere il passo 1,6. </li><li> Continuare con stima concentrazione proteica dei campioni o conservarli a -20 ° C. </li></ol> 2. Concentrazione di proteine ​​stima Utilizzare il test Lowry 7 o il test BCA 8 (Pierce), lo scopo per circa 4,5 mg ml -1. 3. Isoelettrofocusing <ol><li> Rimuovere una striscia ReadyStrip IPG (11 cm, pH 5-8, Bio-Rad)da -20 ° C e lasciarlo equilibrare a temperatura ambiente per 10-15 min. </li><li> Vortice del campione e pipetta 600-800 mcg (volume totale 200 mL) del campione di proteine ​​in linea retta sul bordo posteriore di un canale nel cassetto reidratazione del campione, lasciando circa 1 cm ad ogni estremità. </li><li> Con le pinzette e rimuovere la copertura in plastica della striscia di IPG - assicurarsi di gestire solo le estremità della striscia e di evitare qualsiasi contatto con il gel. Nota di base alla fine della striscia e posizionarla sul lato sinistro del vassoio. Posizionare la striscia IPG gel rivolto verso il basso sulla parte superiore del campione, evitare di intrappolare bolle sotto. Lasciare a reidratare per un&#39;ora. </li><li> Sovrapposizione con 2,5 ml di olio minerale (BioRad). Coprire il vassoio con il coperchio e lasciare a reidratarsi durante la notte a temperatura ambiente. </li><li> Posto uno stoppino di carta su entrambe le estremità del canale vassoio messa a fuoco e bagnate ognuna con 10 microlitri di acqua Millipore. </li><li> Estrarre IPG strip e tenere in verticale per circa 10 secondi lo scarico dell&#39;olio. B asciugare la plasticaACKing con un Kimwipe. </li><li> Posizionare il lato IPG gel striscia verso il basso e con l&#39;estremità di base a sinistra nella barra delle applicazioni di messa a fuoco. Coprire la striscia con 2,5 ml di olio minerale. </li><li> Collocare il vassoio nella cella PROTEAN IEF (Bio-Rad) e programmare un protocollo in 3 fasi (Tabella 1) alla temperatura della cella di default di 20 ° C, una corrente massima di 50 ìA / striscia, e nessun tempo reidratazione. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Tensione </td><td> Tempo </td><td> Volt-Ore </td><td> Rampa </td></tr><tr><td> Fase 1 </td><td> 250 </td><td> 20 min </td><td></td><td> Lineare </td></tr><tr><td> Fase 2 </td><td> 8000 </td><td> 2,5 ore </td><td></td><td> Lineare </td></tr><tr><td> Fase 3 </td><td> 8000 </td><td></td><td> 40.000 </td><td> Rapido </td></tr><tr><td> Totale </td><td></td><td> 6,5 ore </td><td> 40.000 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabella 1. In tre fasi protocollo di cella PROTEAN IEF per 11 centimetri IPG strisce. </li><li> Prendete le strisce IPG fuori dalla cella IEF con pinze. Asciugare il supporto di plastica con una Kimwipe e posizionare il lato gel IPG strip in un vassoio di reidratazione pulito. Si può coprire il vassoio reidratazione e avvolgerlo con pellicola trasparente e conservare a - 80 ° C o procedere. </li></ol> 4. Elettroforesi su gel poliacrilammide SDS <ol><li> Trasferire la striscia (verso l&#39;alto gel) in un vassoio di 11 centimetri equilibrio. </li><li> Aggiungere 4 ml di tampone riduzione (6 M urea, 2% SDS, 0,05 M Tris / HCl pH 8.8, 20% glicerolo, 2% DTT) sul canale ed equilibrare la striscia per 10 minuti con agitazione lieve. </li><li> Rimuovere il tampone riduzione, aggiungere 4 ml di tampone alchilazione (6 M urea, 2% SDS, 0,05 M Tris / HCl pH 8.8, 20% glicerolo, 2.5% Iodoacetamide) ed equilibrare la striscia per 10 minuti con agitazione lieve. </li><li> Sciacquare la striscia IPG immergendo il Stribrevemente p in 1 tampone X SDS in esecuzione (25 mM Tris, 192 mM glicina, 0,1% SDS, pH 8,2). </li><li> Posare il lato gel striscia fino alla piastra posteriore del cm 11 Criterio prefabbricati 10,5% -14% Tris-HCl gel di poliacrilammide SDS (Bio-Rad) e spingere delicatamente in modo che rende pieno contatto con il gel SDS; accertarsi che non vi siano bolle intrappolate tra le due superfici del gel. </li><li> Sovrapposizione la striscia IPG con 1 ml di soluzione di agarosio fuso (0,5% agarosio, 25 mM Tris, 192 mM glicina, 0,1% SDS, bromofenolo blu) e lasciare che l&#39;agarosio solidificare per 5 minuti. </li><li> Di carico 5 l di marker proteici 10-225 kDa (USB, P / N: 76740) nel singolo pozzo come standard di peso molecolare. </li><li> Esegui il gel in SDS tampone (25 mM Tris, 192 mM glicina, 0,1% SDS, pH 8,2) a 200 V a temperatura ambiente o in una stanza fredda (4 ° C) utilizzando il bromofenolo migrazione fronte del colorante blu per monitorare la elettroforesi. </li><li> Rimuovere il gel dal cast di plastica e macchie durante la notte con una leggera agitazione in Coomassie Brilliant BlueR-250 macchia (45,5% di metanolo, dH2O 45,5%, 9,0% di acido acetico, 0,25% Coomassie Brilliant Blue R-250). </li><li> Agitare il gel in Decolorare soluzione 1 (45,5% metanolo, 45,5% dH 2 O, 9,0% di acido acetico) due volte per 3 ore ciascuna e in Decolorare 2 (5% di metanolo, 90% dH 2 O, 5% di acido acetico) durante la notte. Conservare il gel in 7% di acido acetico per l&#39;analisi. </li></ol> 5. Gel di imaging e di analisi <ol><li> Catturare le immagini dei gel utilizzando il software Un programma Quantità VersaDoc che gestisce il sistema di imaging (BioRad). Ritaglia le aree dell&#39;immagine in modo uniforme per tutti i gel nell&#39;esperimento. </li><li> Caricare le immagini ritagliate su PDQuest il programma 8,0 software per creare un set esperimento. Seguire la procedura guidata di configurazione delle prove per definire i parametri per la rilevazione di spot e punto di corrispondenza in tutto il gel. Ispezionare e perfezionare il punto di corrispondenza risultati manualmente, se necessario. </li><li> Effettuare un&#39;analisi quantitativa e statistica del gel per rilevare i punti di proteine ​​abbinato con twdifferenze statisticamente significative o-fold o superiore di espressione tra i due gruppi gel. Crea un set di analisi di questi punti di interesse e tagliarli con l&#39;ausilio di una taglierina posto EXQuest (BioRad) tripsina per la digestione e LC-MS-base l&#39;identificazione delle proteine. </li></ol> 6. In-gel digestione trittico Per questo passo un Pierce modificato In-Gel Tryptic Digest Kit (# 89871X, Pierce) viene utilizzato il protocollo. <ol><li> Aggiungere 200 ml di soluzione di decolorazione (25 bicarbonato di ammonio mM, 50% acetonitrile) per le spine gel. Vortex e incubare i campioni a 37 ° C per 30 minuti con agitazione. Rimuovere con cautela e scartare la soluzione. </li><li> Ripetere il punto 6.1. </li><li> Aggiungere 30 ml di preparati al momento tampone riduzione (50 mM Tris [2-carbossietil] fosfina, bicarbonato di ammonio 22,5 mm) per i tubi contenenti i tappi di gel e incubare a 60 ° C per 10 minuti. </li><li> Lasciare raffreddare i campioni, poi rimuovere ed eliminare il buffer riducente.</li><li> Aggiungere 30 ml di tampone alchilazione (100 Iodoacetamide mM, 20 mM di bicarbonato di ammonio, preparata immediatamente prima dell&#39;uso, avvolto in un foglio di tubi. Incubare i campioni al buio a temperatura ambiente per 1 ora. </li><li> Rimuovere e gettare il buffer alchilazione. Lavare le spine gel con l&#39;aggiunta di 200 ml di soluzione di decolorazione ad ogni provetta. Incubare i campioni a 37 ° C per 15 minuti. </li><li> Rimuovere e scartare la soluzione di decolorazione e ripetere il lavaggio. </li><li> Aggiungere 50 ml di acetonitrile alle spine gel e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente per permettere loro di ridursi a secco, poi rimuovere con attenzione il acetonitrile. </li><li> Ripetere il passo 6,8 ancora una volta. Pezzi di gel dovrebbe apparire bianco e di piccole dimensioni. </li><li> Lasciare pezzi gel ad asciugare in un concentratore Centrivap (Labconco, modello EX1245) per 10 minuti. </li><li> Swell i pezzi di gel aggiungendo 10 ml di soluzione attivata tripsina (10 tripsina ng / mL, 25 mM di bicarbonato di ammonio). Incubare a temperatura ambiente per 15 minuti. </li><li> Aggiungere 25 microlitri di buffer digestione (25 bicarbonato di ammonio mM) per i tubi. Incubare i campioni a temperatura ambiente per una notte con agitazione. </li><li> Sonicare i campioni per 10 minuti (Branson, sonicatore modello da bagno 2510) e spin giù prima di rimuovere il surnatante in una nuova provetta. Salva il surnatante. </li><li> Per ulteriori estrarre peptidi, aggiungere 10 ml di 0,1% di acido formico e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente con agitazione. Sonicare i campioni per 10 minuti, raccogliere il surnatante e si combinano con surnatante salvato nel passaggio 6.13. </li></ol> 7. Dissalazione microscala di estratti peptide <ol><li> Rimuovere bicarbonato di ammonio e altri sali negli estratti peptide con l&#39;aiuto di PepClean C-18 Colonne Spin (ThermoFisher) secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Peptidi eluire due volte con 20 microlitri acetonitrile 70%, evaporare a secco i campioni mediante centrifugazione del concentratore Centrivap per 1 ora e risospenderei peptidi in 10 microlitri di acido formico 0,1% per l&#39;analisi MS. </li></ol> 8. L&#39;identificazione delle proteine ​​mediante HPLC-spettrometria di massa accoppiata <ol><li> Separato da 5 ml di miscela di peptidi su un cromatografo liquido ad alte prestazioni (HPLC) oltre 40 minuti, utilizzando un gradiente lineare di acetonitrile 2-50% con lo 0,2% di acido formico in una Pepswift monolitico PS-DVB colonna (Dionex) accoppiato ad un nanospray I origine su uno spettrometro di massa di ioni trappola (LCQ Deca XP Max, Thermo Fisher Scientific) ad un flusso di 400 nL / min alla punta. </li><li> Rileva peptide MS1 segnali tra i 400 - 1400 m / z e consentono di 3 picchi più intensi di ioni ad essere isolati per MS2 sequenziamento da CID con esclusione dinamico. </li><li> Per l&#39;identificazione delle proteine, analizzare i risultati peptide attraverso una ricerca Sequest banca dati di riferimento del mouse (BioWorks software, Thermo-Fisher Scientific) con una modifica statica cisteina alchilati e modifiche dinamico per fosforilazione (serina, treonina, tirosina), metilazionezione (istidina), ossidazione (metionina), ADP-ribosilazione (arginina), e N-terminale acetilazione. Applicare criteri di corrispondenza conservativo (ad esempio, la tolleranza peptide impostato su 2 AMU e 1,00 tolleranza frammento, le proteine ​​contengono almeno 2 peptidi superamento di un Xcorr vs carica dello Stato filtro [z = 1 / x = 1,5, z = 2 / x = 2.00, z = 3 / x = 2.50, z = 4 / x = 3.00] e una probabilità di p &lt;0.05) 5 e ispezionare manualmente gli spettri MS per l&#39;identificazione delle proteine ​​fiducioso. </li></ol> 9. Rappresentante dei risultati: Maschio e femmina non esercitati, murino muscolo scheletrico (bicipite brachiale) è stato estratto e separato in una mappa bidimensionale 5, il primo livello del muscolo proteoma comparativa (Figura 2). Una volta visualizzato usando ad alta risoluzione, immagini digitali, circa 800 spot proteici sono stati individuati in ciascuna. Utilizzando la mappa maschile proteoma come base, è chiaro che ci sono molti luoghi che cambiano in abbondanza nel proteoma femminile. Le intensità spot sono<html> misure del cambiamento nella quantità di proteine ​​(Figura 3). Le identità dei luoghi proteine ​​che cambiano più di due volte (su o giù) e sono statisticamente significativi (p &lt;0,05) con n = 5 topi, sono determinate con l&#39;analisi della sequenza degli aminoacidi utilizzando cromatografia liquida-spettrometria di massa accoppiata. Questi risultati mostrano che le donne dimostrano una diminuzione dell&#39;abbondanza degli enzimi del metabolismo degli zuccheri ed energia nelle enzima creatin chinasi (CK) isoforme, un diverso sistema di approvvigionamento energetico nei muscoli. Sia nell&#39;uomo e negli animali superiori maschi visualizzare i livelli sierici di CK a riposo e dopo esercizio 9,10, ma i livelli sierici di CK non sono necessariamente correlati con la quantità di interruzione miofibrillare 11,12. Questo dimorfismo di genere nel abbondanza cellulare del CK in murino muscolo bicipite brachiale è un romanzo finding5 e può rispondere alla fisiologicamente diversi livelli sierici di CK. Figure: g1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Una schematica generale del protocollo per la proteomica comparativa. Il protocollo è suddiviso in tre gruppi: preparazione del campione, l&#39;analisi del campione e, l&#39;identificazione delle proteine. Le estremità di ognuno di questi tre gruppi di protocolli sono ragionevoli luoghi pausa, anche se i risultati migliori sono guadagnato se il protocollo generale è svolta senza fermarsi. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3536/3536fig2.jpg" /> Figura 2. Confronto di femmina murini di proteine ​​del bicipite brachiale punti rispetto ai luoghi identici nel maschio bicipite brachiale (verde circoli o). Punti che l&#39;aumento maggiore o uguale a due volte nelle femmine sono cerchiati rosso (o) e quelli che la diminuzione minore o uguale a due volte sono cerchiati blu (o). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3536/3536fig3.jpg" /> Figura 3 Analisi Spot Gel Intensity:. Asse X, femminapre-esercizio (controllo, n = 5); asse Y, singolo femminile attacco 0 gruppo di punti di tempo h (n = 5). Retta di regressione: coefficiente di correlazione = 0,919; pendenza = 0,976; intercettare = -0,0293. Punti al di sopra della linea rossa e sotto la linea blu cambiare più di + / - due volte.

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

LC / MS metodo proteomica qui presentato è un protocollo più affidabile e riproducibile per una rapida analisi del primo livello del proteoma del muscolo scheletrico. Esso permette un confronto ragionevole espediente della specificità di genere. Proteine ​​a bassa abbondanza richiederebbe un frazionamento del campione di muscolo di rimuovere il maggior numero di proteine ​​contrattili possibile, aumentando così le proteine ​​poco abbondanti. Sartoria del profilo proteomico può essere realizzato con strisce di gamma diversa di pH IPG e si alternano gel gradiente percentuale se lo si desidera. Macchie fluorescenti più sensibili esistono, ma si consiglia ad ogni laboratorio di determinare la linearità di queste macchie nel vostro sistema. Per un&#39;analisi più rigorosa di espressione della proteina del sistema DIGE (bidimensionale In-gel elettroforesi sistema, GE Healthcare Life Sciences) può essere utilizzata, ma questo aggiunge un livello di complessità della metodologia. Inoltre, il protocollo qui descritto può essere utilizzato con la maggior parte aniMal tessuti per i quali un genoma è stato sequenziato, così come il sequenziamento de novo di una proteina da qualsiasi fonte, a condizione che esso possa essere risolto su un gel bidimensionale, in quanto si sovrappongono frammenti enzimatici può essere generato usando enzimi di elevata purezza, oltre di tripsina. Campioni provenienti da fonti di altri tessuti potrebbe richiedere alcune modifiche nella metodologia di estrazione, soprattutto se in cerca di proteine ​​di membrana idrofobica e, comunque, abbiamo avuto buoni risultati con questo protocollo con cardiaco, fegato, reni e tessuti cerebrali. Altre modificazioni post-traduzionali possono essere rilevati modificando la massa spettro criteri di ricerca del database. In sintesi, abbiamo presentato un protocollo abbastanza dettagliata profilazione iniziale per l&#39;analisi del proteoma.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Tipo </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti </th></tr><tr><td> PepClean C-18 Spin Colonne </td><td> Di consumo </td><td> ThermoFisher Scientifico </td><td> PI-89870 </td><td></td></tr><tr><td> Monolitico Pepswift colonna (100um x 5 cm) </td><td> Di consumo </td><td> Dionex </td><td> 162348 </td><td></td></tr><tr><td> Criterio pre-cast 10,5% -14% Tris-HCl SDS poliacrilammide gel </td><td> Di consumo </td><td> BioRad </td><td> 345-0106 </td><td></td></tr><tr><td> Readystrip strisce IPG </td><td> Di consumo </td><td> BioRad </td><td> Variare del pH gamme </td><td></td></tr><tr><td> L&#39;acido acetico </td><td> Reagente </td><td> Fisher Scientific </td><td> A465-1 </td><td></td></tr><tr><td> Acetone </td><td> Reagente </td><td> Pharmco </td><td> 329000 </td><td></td></tr><tr><td> Acetonitrile </td><td> Reagente </td><td> Fisher Scientific </td><td> A955 </td><td></td></tr><tr><td> Agarose </td><td> Reagente </td><td> BioRad </td><td> 163-2111 </td><td> Copertura soluzione </td></tr><tr><td> Bicarbonato di ammonio </td><td> Reagente </td><td> Fluka </td><td> 40867 </td><td></td></tr><tr><td> Bromofenolo blu </td><td> Reagente </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP114 </td><td></td></tr><tr><td> Bio-Lyte Ampholytes </td><td> Reagente </td><td> BioRad </td><td></td><td> Variare del pH gamme </td></tr><tr><td> CHAPS </td><td> Reagente </td><td> USB </td><td> 13361 </td><td></td></tr><tr><td> Commassie blu R-250 </td><td> Reagente </td><td> ThermoFisher Scientifico </td><td> 20278 </td><td></td></tr><tr><td> Ditiotreitolo (DTT) </td><td> Reagente </td><td> USB </td><td> 15395 </td><td></td></tr><tr><td> Acido formico </td><td> Reagente </td><td> ThermoFisher Scientifico </td><td> 28905 </td><td></td></tr><tr><td> Glicerina </td><td> Reagente </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G6279 </td><td></td></tr><tr><td> Glicina </td><td> Reagente </td><td> USB </td><td> 16407 </td><td></td&gt; </tr><tr><td> Iodoacetamide </td><td> Reagente </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I6125 </td><td></td></tr><tr><td> Metanolo </td><td> Reagente </td><td> Fisher Scientific </td><td> A452 </td><td></td></tr><tr><td> Olio minerale </td><td> Reagente </td><td> BioRad </td><td> 163-2129 </td><td></td></tr><tr><td> Sodio dodecil solfato </td><td> Reagente </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> L6026 </td><td></td></tr><tr><td> Tris di base </td><td> Reagente </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 93349 </td><td></td></tr><tr><td> Tris [2-carboexyethyl] fosfina </td><td> Reagente </td><td> ThermoFisher Scientifico </td><td> 77720 </td><td></td></tr><tr><td> Tripsina Endoproteinase, TPCK trattati, MS grado </td><td> Reagente </td><td> Perforare </td><td> 90055 </td><td> modificato </td></tr><tr><td> Urea </td><td> Reagente </td><td> USB </td><td> 75826 </td><td></td></tr><tr><td> Acqua </td><td> Reagente </td><td> Burdick &amp; Jackson </td><td> 365 </td><td></td></tr><tr><td> Centrivap concentratore </td><td> TOOL </td><td> Labconco </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Exquest posto taglierina </td><td> Strumento </td><td> BioRad </td><td></td><td></td></tr><tr><td> LCQ Deca XP Max ioni trappola spettrometro di massa </td><td> Strumento </td><td> ThermoFisher Scientifico </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Motorizzato pestello </td><td> Strumento </td><td> Kontes Corp </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Polipropilene mescolando </td><td> Strumento </td><td> Biospec Prod </td><td></td><td></td></tr><tr><td> aste </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> PROTEAN IEF cellulare </td><td> Strumento </td><td> BioRad </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ultrasuoni </td><td> Strumento </td><td> Branson </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Geometra Inoltre HPLC sistema </td><td> Strumento </td><td> ThermoFisher Scientifico </td><td></td><td></td></tr><tr><td> VersaDoc immagini sistema </td><td> Strumento </td><td> BioRad </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

skeletal muscle gender dimorphism from proteomics

Lordo in contrazione del muscolo scheletrico è principalmente determinato da un numero relativamente piccolo di proteine ​​contrattili, ma questo tessuto è anche straordinariamente adattabile a fattori ambientali 1 come l&#39;ipertrofia da esercizi di resistenza e atrofia da disuso. Si presenta così il rimodellamento e adattamenti ai fattori di stress (calore, ischemia, metalli pesanti, ecc.) 2,3. Il danno può verificarsi al muscolo da una forza muscolare esercitando allo stesso tempo allunga, i cosiddetti 4 contrazione eccentrica. Le proteine ​​contrattili può essere danneggiato in questi sforzi e hanno bisogno di essere riparato, degradati e / o sintetizzati, queste funzioni non fanno parte delle proteine ​​contrattili, ma di altre proteine ​​molto meno abbondante nella cellula. Per stabilire quali sottoinsieme di proteine ​​è coinvolta nel miglioramento di questo tipo di danno, un proteoma globale deve essere stabilita prima dell&#39;esercizio 5 e poi seguito successivamente l&#39;esercizio per determinare il differenzialeespressione della proteina e, quindi, evidenziare proteine ​​candidate negli adattamenti di danni e la sua riparazione. Inoltre, la maggior parte degli studi del muscolo scheletrico sono stati condotti sul maschio della specie e quindi non può essere rappresentativo del muscolo femminile. In questo articolo vi presentiamo un metodo per l&#39;estrazione di proteine ​​riproducibile dai muscoli maschili e femminili, tra di loro di elettroforesi bidimensionale del gel seguito da digitale ad alta risoluzione di immagini 6. Questo fornisce un protocollo per i punti (e proteine ​​successivamente identificati) che mostrano un aumento statisticamente significativo (p &lt;0,05) due volte aumentare o diminuire, appaiono o scompaiono dallo stato di controllo. Questi vengono poi asportati, digerito con tripsina e separati da alta pressione cromatografia liquida accoppiata ad uno spettrometro di massa (LC / MS) per l&#39;identificazione delle proteine ​​(LC / MS / MS) 5. Questa metodologia (Figura 1) può essere utilizzato su molti tessuti con poca o nessuna modifica (fegato, cervello, sentiret, ecc.).

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Skeletal Muscle Gender Dimorphism from Proteomics

Un straight-forward insieme di metodi per isolare e determinare l&#39;identità delle proteine ​​più abbondanti espresse nel muscolo scheletrico. Circa 800 punti sono discernimento su un gel bidimensionale da 10 mg muscolare, che ci permette per la determinazione del sesso-specifico l&#39;espressione della proteina. Questi metodi forniscono risultati equivalenti nella maggior parte dei tessuti.

Sesso Dimorfismo muscolo scheletrico da Proteomica

Gross contraction in skeletal muscle is primarily determined by a relatively small number of contractile proteins, however this tissue is also remarkably ...

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12.4K Views.  Smith College. Un straight-forward insieme di metodi per isolare e determinare l'identità delle proteine ​​più abbondanti espresse nel muscolo scheletrico. Circa 800 punti sono discernimento su un gel bidimensionale da 10 mg muscolare, che ci permette per la determinazione del sesso-specifico l'espressione della proteina. Questi metodi forniscono risultati equivalenti nella maggior parte dei tessuti.

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Myo-mechanical Analysis of Isolated Skeletal Muscle

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for the treatment of muscle disease 1,2,3, quantitative methods are needed that measure force generation and fatigability in treated muscle. We describe a detailed approach to evaluating myo-mechanical properties in freshly explanted hindlimb muscle from the mouse. We describe the atraumatic harvest of mouse extensor digitorum longus muscle, mounting the muscle in a muscle strip myograph (Model 820MS; Danish Myo Technology), and the measurement of maximal twitch and tetanic tension, contraction time, and half-relaxation time, using a square pulse stimulator (Model S48; Grass Technologies). Using these measurements, we demonstrate the calculation of specific twitch and tetanic tension normalized to muscle cross-sectional area, the twitch-to-tetanic tension ratio, the force-frequency relationship curve and the low frequency fatigue curve 4. This analysis provides a method for quantitative comparison between therapeutic interventions in mouse models of muscle disease 1,2,3,5, as well as comparison of the effects of genetic modification on muscle function 6,7,8,9.

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for muscle disease, methods are needed to quantitate force generation and fatigability in treated muscle. We detail an approach to evaluating myo-mechanical properties in explanted mouse hindlimb muscle. This analysis provides a robust approach to quantitating the effects of genetic modification on muscle function, as well as comparison of therapies in mouse models of muscle disease.

Myo-meccanico Analisi dei isolata del muscolo scheletrico

To assess the in vivo effects of therapeutic interventions for the treatment of muscle disease 1,2,3, quantitative methods are needed that measure force ...

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Tibial Nerve Transection - A Standardized Model for Denervation-induced Skeletal Muscle Atrophy in Mice

The tibial nerve transection model is a well-tolerated, validated, and reproducible model of denervation-induced skeletal muscle atrophy in rodents. Although originally developed and used extensively in the rat due to its larger size, the tibial nerve in mice is big enough that it can be easily manipulated with either crush or transection, leaving the peroneal and sural nerve branches of the sciatic nerve intact and thereby preserving their target muscles. Thus, this model offers the advantages of inducing less morbidity and impediment of ambulation than the sciatic nerve transection model and also allows investigators to study the physiologic, cellular and molecular biologic mechanisms regulating the process of muscle atrophy in genetically engineered mice. The tibial nerve supplies the gastrocnemius, soleus and plantaris muscles, so its transection permits the study of denervated skeletal muscle composed of fast twitch type II fibers and/or slow twitch type I fibers. Here we demonstrate the tibial nerve transection model in the C57Black6 mouse. We assess the atrophy of the gastrocnemius muscle, as a representative muscle, at 1, 2, and 4 weeks post-denervation by measuring muscle weights and fiber type specific cross-sectional area on paraffin-embedded histologic sections immunostained for fast twitch myosin.

The tibial nerve transection model is a well-tolerated, validated, and reproducible model of skeletal muscle atrophy. The model surgical protocol is described and demonstrated in C57Black6 mice. &#160;

Resezione del nervo tibiale - Un modello standardizzato per Denervation indotta scheletrico atrofia muscolare nei topi

The tibial nerve transection model is a well-tolerated, validated, and reproducible model of denervation-induced skeletal muscle atrophy in rodents. ...

Human Skeletal Muscle Biopsy Procedures Using the Modified Bergstr&#246;m Technique

The percutaneous biopsy technique enables researchers and clinicians to collect skeletal muscle tissue samples. The technique is safe and highly effective. This video describes the percutaneous biopsy technique using a modified Bergstr&#246;m needle to obtain skeletal muscle tissue samples from the vastus lateralis of human subjects. The Bergstr&#246;m needle consists of an outer cannula with a small opening (&#8216;window&#8217;) at the side of the tip and an inner trocar with a cutting blade at the distal end. Under local anesthesia and aseptic conditions, the needle is advanced into the skeletal muscle through an incision in the skin, subcutaneous tissue, and fascia. Next, suction is applied to the inner trocar, the outer trocar is pulled back, skeletal muscle tissue is drawn into the window of the outer cannula by the suction, and the inner trocar is rapidly closed, thus cutting or clipping the skeletal muscle tissue sample. The needle is rotated 90&#176;&#160;and another cut is made. This process may be repeated three more times. This multiple cutting technique typically produces a sample of 100-200 mg or more in healthy subjects and can be done immediately before, during, and after a bout of exercise or other intervention. Following post-biopsy dressing of the incision site, subjects typically resume their activities of daily living right away and can fully participate in vigorous physical activity within 48-72 hr. Subjects should avoid heavy resistance exercise for 48 hr to reduce the risk of herniation of the muscle through the incision in the fascia.

Human Skeletal Muscle Biopsy Procedures Using the Modified Bergstr&amp;#246;m Technique

The purpose of this video is to present the modified Bergstr&#246;m skeletal muscle biopsy technique on human subjects.

Scheletrici Procedure biopsia muscolare dell&#39;uomo con la tecnica Bergström Modificato

The percutaneous biopsy technique enables researchers and clinicians to collect skeletal muscle tissue samples. The technique is safe and highly ...

Preparation and Respirometric Assessment of Mitochondria Isolated from Skeletal Muscle Tissue Obtained by Percutaneous Needle Biopsy

Respirometric profiling of isolated mitochondria is commonly used to investigate electron transport chain function. We describe a method for obtaining samples of human Vastus lateralis, isolating mitochondria from minimal amounts of skeletal muscle tissue, and plate based respirometric profiling using an extracellular flux (XF) analyzer. Comparison of respirometric profiles obtained using 1.0, 2.5 and 5.0 &#956;g of mitochondria indicate that 1.0 &#956;g is sufficient to measure respiration and that 5.0 &#956;g provides most consistent results based on comparison of standard errors. Western blot analysis of isolated mitochondria for mitochondrial marker COX IV and non-mitochondrial tissue marker GAPDH indicate that there is limited non-mitochondrial contamination using this protocol. The ability to study mitochondrial respirometry in as little as 20 mg of muscle tissue allows users to utilize individual biopsies for multiple study endpoints in clinical research projects.

Methods for biopsy of Vastus lateralis, preparation of purified mitochondria, and respirometric profiling are described. The use of small muscle volume makes this technique suitable for clinical research applications.

Preparazione e respirometrici valutazione dei mitocondri isolati dal tessuto muscolare scheletrico Ottenuto dalla biopsia percutanea

Respirometric profiling of isolated mitochondria is commonly used to investigate electron transport chain function. We describe a method for obtaining ...

Quantitative Magnetic Resonance Imaging of Skeletal Muscle Disease

Quantitative magnetic resonance imaging (qMRI) describes the development and use of MRI to quantify physical, chemical, and/or biological properties of living systems. Neuromuscular diseases often exhibit a temporally varying, spatially heterogeneous, and multi-faceted pathology. The goal of this protocol is to characterize this pathology using qMRI methods. The MRI acquisition protocol begins with localizer images (used to locate the position of the body and tissue of interest within the MRI system), quality control measurements of relevant magnetic field distributions, and structural imaging for general anatomical characterization. The qMRI portion of the protocol includes measurements of the longitudinal and transverse relaxation time constants (T1 and T2, respectively). Also acquired are diffusion-tensor MRI data, in which water diffusivity is measured and used to infer pathological processes such as edema. Quantitative magnetization transfer imaging is used to characterize the relative tissue content of macromolecular and free water protons. Lastly, fat-water MRI methods are used to characterize fibro-adipose tissue replacement of muscle. In addition to describing the data acquisition and analysis procedures, this paper also discusses the potential problems associated with these methods, the analysis and interpretation of the data, MRI safety, and strategies for artifact reduction and protocol optimization.

Neuromuscular diseases often exhibit a temporally varying, spatially heterogeneous, and multi-faceted pathology. The goal of this protocol is to characterize this pathology using non-invasive magnetic resonance imaging methods.

Quantitative Magnetic Resonance Imaging di malattia muscolare scheletrico

Quantitative magnetic resonance imaging (qMRI) describes the development and use of MRI to quantify physical, chemical, and/or biological properties of ...

Human Vastus Lateralis Skeletal Muscle Biopsy Using the Weil-Blakesley Conchotome

Percutaneous muscle biopsy using the Weil-Blakesley conchotome is well established in both clinical and research practice. It is a safe, effective and well tolerated technique. The Weil-Blakesley conchotome has a sharp biting tip with a 4 - 6 mm wide hollow. It is inserted through a 5 - 10 mm skin incision and can be maneuvered for controlled tissue penetration. The tip is opened and closed within the tissue and then rotated through 90 -180&#176; to cut the muscle. The amount of muscle obtained following repeated sampling can vary from 20 mg to 290 mg which can be processed for both histology and molecular studies. The wound needs to be kept dry and vigorous physical activity kept to a minimum for approximately 72 hr although normal levels of activity can restart immediately following the procedure. This procedure is safe and effective when close attention is paid to the selection of subjects, full asepsis and post procedure care. &#160;Both right and left vastus lateralis are suitable for biopsy dependent on participant preference.

Human Vastus Lateralis Skeletal Muscle Biopsy Using the Weil-Blakesley Conchotome

This video demonstrates the technique of percutaneous muscle biopsy of the human vastus lateralis using the Weil-Blakesley conchotome.

Umano<em&gt; vasto laterale</em&gt; Biopsia muscolare scheletrico Utilizzando la Weil-Blakesley Conchotome

Percutaneous muscle biopsy using the Weil-Blakesley conchotome is well established in both clinical and research practice. It is a safe, effective and ...

Induction and Assessment of Exertional Skeletal Muscle Damage in Humans

Contraction-induced muscle damage via voluntary eccentric (lengthening) contractions offers an excellent model for studying muscle adaptation and recovery in humans. Herein we discuss the design of an eccentric exercise protocol to induce damage in the quadriceps muscles, marked by changes in strength, soreness, and plasma creatine kinase levels. This method is simple, ethical, and widely applicable since it is performed in human participants and eliminates the interspecies translation of the results. Subjects perform 300 maximal eccentric contractions of the knee extensor muscles at a speed of 120&#176;/sec on an isokinetic dynamometer. The extent of the damage is measurable using relatively non-invasive isokinetic and isometric measures of strength loss, soreness, and plasma creatine kinase levels over several days following the exercise. Therefore, its application can be directed to specific populations in an attempt to identify mechanisms for muscle adaptation and regeneration.

This article describes a safe and reliable method to induce and quantify exertional skeletal muscle damage in human subjects.

Induzione e valutazione di Exertional scheletrico danno muscolare negli esseri umani

Contraction-induced muscle damage via voluntary eccentric (lengthening) contractions offers an excellent model for studying muscle adaptation and recovery ...

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo and noninvasively in humans via phosphorus-31 magnetic resonance spectroscopy (31PMRS). However, the approach has not been widely adopted in translational and clinical research, with variations in methodology and limited guidance from the literature. Increased optimization, standardization, and dissemination of methods for in vivo 31PMRS would facilitate the development of targeted therapies to improve OXPHOS capacity and could ultimately favorably impact cardiovascular health. 31PMRS produces a noninvasive, in vivo measure of OXPHOS capacity in human skeletal muscle, as opposed to alternative measures obtained from explanted and potentially altered mitochondria via muscle biopsy. It relies upon only modest additional instrumentation beyond what is already in place on magnetic resonance scanners available for clinical and translational research at most institutions. In this work, we outline a method to measure in vivo skeletal muscle OXPHOS. The technique is demonstrated using a 1.5 Tesla whole-body MR scanner equipped with the suitable hardware and software for 31PMRS, and we explain a simple and robust protocol for in-magnet resistive exercise to rapidly fatigue the quadriceps muscle. Reproducibility and feasibility are demonstrated in volunteers as well as subjects over a wide range of functional capacities.

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

This work demonstrates the feasibility of an in vivo phosphorus-31 magnetic resonance spectroscopy (31PMRS) technique to quantify mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity in human skeletal muscle.

Fosforo-31 spettroscopia di risonanza magnetica: uno strumento per misurare<em&gt; In Vivo</em&gt; Capacità fosforilazione ossidativa mitocondriale nel muscolo scheletrico umano

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

Semi-automated Analysis of Mouse Skeletal Muscle Morphology and Fiber-type Composition

For years, distinctions between skeletal muscle fiber types were best visualized by myosin-ATPase staining. More recently, immunohistochemical staining of myosin heavy chain (MyHC) isoforms has emerged as a finer discriminator of fiber-type. Type I, type IIA, type IIX and type IIB fibers can now be identified with precision based on their MyHC profile; however, manual analysis of these data can be slow and down-right tedious. In this regard, rapid, accurate assessment of fiber-type composition and morphology is a very desirable tool. Here, we present a protocol for state-of-the-art immunohistochemical staining of MyHCs in frozen sections obtained from mouse hindlimb muscle in concert with a novel semi-automated algorithm that accelerates analysis of fiber-type and fiber morphology. As expected, the soleus muscle displayed staining for type I and type IIA fibers, but not for type IIX or type IIB fibers. On the other hand, the tibialis anterior muscle was composed predominantly of type IIX and type IIB fibers, a small fraction of type IIA fibers and little or no type I fibers. Several image transformations were used to generate probability maps for the purpose of measuring different aspects of fiber morphology (i.e., cross-sectional area (CSA), maximal and minimal Feret diameter). The values obtained for these parameters were then compared with manually-obtained values. No significant differences were observed between either mode of analysis with regards to CSA, maximal or minimal Feret diameter (all p &#62; 0.05), indicating the accuracy of our method. Thus, our immunostaining analysis protocol may be applied to the investigation of effects on muscle composition in many models of aging and myopathy.

Immunohistochemical staining of myosin heavy chain isoforms has emerged as the state-of-the-art discriminator of skeletal muscle fiber-type (i.e., type I, type IIA, type IIX, type IIB). Here, we present a staining protocol along with a novel semi-automated algorithm that facilitates rapid assessment of fiber-type and fiber morphology.

Analisi semi-automatica del Mouse del muscolo scheletrico morfologia e composizione di fibra-tipo

For years, distinctions between skeletal muscle fiber types were best visualized by myosin-ATPase staining. More recently, immunohistochemical staining of ...

Skeletal Muscle Neurovascular Coupling, Oxidative Capacity, and Microvascular Function with 'One Stop Shop' Near-infrared Spectroscopy

Exercise represents a major hemodynamic stress that demands a highly coordinated neurovascular response in order to match oxygen delivery to metabolic demand. Reactive hyperemia (in response to a brief period of tissue ischemia) is an independent predictor of cardiovascular events and provides important insight into vascular health and vasodilatory capacity. Skeletal muscle oxidative capacity is equally important in health and disease, as it determines the energy supply for myocellular processes. Here, we describe a simple, non-invasive approach using near-infrared spectroscopy to assess each of these major clinical endpoints (reactive hyperemia, neurovascular coupling, and muscle oxidative capacity) during a single clinic or laboratory visit. Unlike Doppler ultrasound, magnetic resonance images/spectroscopy, or invasive catheter-based flow measurements or muscle biopsies, our approach is less operator-dependent, low-cost, and completely non-invasive. Representative data from our lab taken together with summary data from previously published literature illustrate the utility of each of these end-points. Once this technique is mastered, application to clinical populations will provide important mechanistic insight into exercise intolerance and cardiovascular dysfunction.

Skeletal Muscle Neurovascular Coupling, Oxidative Capacity, and Microvascular Function with &#039;One Stop Shop&#039; Near-infrared Spectroscopy

Here, we describe a simple, non-invasive approach using near-infrared spectroscopy to assess reactive hyperemia, neurovascular coupling and skeletal muscle oxidative capacity in a single clinic or laboratory visit.

Muscolo scheletrico Neurovascular accoppiamento, capacità ossidativa e funzione microvascolare con 'One Stop Shop' spettroscopia nel vicino infrarosso

Exercise represents a major hemodynamic stress that demands a highly coordinated neurovascular response in order to match oxygen delivery to metabolic ...