Gli autori desiderano ringraziare Nicole M. Nemeth (Università della Georgia) e Jeanne M. Fair (LANL) per il loro aiuto nella raccolta tessuti di pollo, e Steven A. Springer per il suo aiuto durante le riprese. La cura di tutti gli uccelli in questo studio era in conformità con le linee guida del National Institutes of Salute per l&#39;uso umano degli animali da laboratorio e tutti i protocolli sono stati approvati dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale Usa presso il Los Alamos National Security LLC, operatore del Los Alamos Laboratorio Nazionale nell&#39;ambito del contratto n ° DE-AC52-06NA25396 con il Dipartimento dell&#39;Energia degli Stati Uniti. La cura dei topi in questo studio è conforme al protocollo UCSD animale approvato. I tessuti umani sono stati ottenuti come parte del protocollo UCSD IRB approvato. Questo lavoro è stato sostenuto dalla concessione 118645 presso la University of California Programma Fee Lab Presidente (PG) e la concessione NS047101 dal National Institute of Neurological Disorder and Stroke (Fondo Microscopia Neuroscienze in comune, UC San Diego).

1. Embedding Tissue in OCT <ol><li> Preparare un bagno di congelamento con l&#39;aggiunta di ghiaccio secco a 2-metil butano in una scatola di polistirolo poco profonda. </li><li> Raccogliere il tessuto, e delicatamente umido su un fazzoletto di carta per asciugare il liquido in eccesso. Se si utilizza lo snap-frozen tessuto (tessuto che è stato congelato in azoto liquido), consentono il tessuto riscaldare fino a -20 ° C, collocandolo in un microtomo crio-camera. </li><li> Aggiungere una piccola quantità di Office per il Peel-A-Way stampo congelamento, quanto basta per coprire il fondo dello stampo. </li><li> Posizionare il tessuto nello stampo, assicurarsi che il tessuto viene appoggiato sul fondo dello stampo l&#39;orientamento desiderato. Una volta congelato, il blocco di tessuto sarà sezionato o dal basso o dai lati. </li><li> Coprire il tessuto con OCT, e mettere lo stampo nel bagno di congelamento. Il composto ottobre diventa bianca come il tessuto si blocca. </li><li> Una volta congelato, sbucciare lo stampo fuori dal blocco congelato e mettere in un sacco marcata congelamento. </li><li> I blocchi possono essere conservati congelatia -80 ° C fino all&#39;utilizzo. </li></ol> 2. Tissue Sezionamento <ol><li> Tessuto Collocare dei blocchi nella crio-microtomo camera, e consentire loro di raggiungere -20 ° C (circa 30 min). </li><li> Tagliare una sezione 3-5 um di spessore, e posizionare un vetrino caricato positivamente sulla sommità della sezione. Il tessuto si atterrà alla diapositiva. </li><li> Far asciugare i tessuti per 30-60 min. </li><li> Le slitte possono essere utilizzati in questa fase, oppure possono essere conservati a -80 ° C per utilizzo futuro. </li></ol> 3. Colorazione dei tessuti <ol><li> Vetrini che sono stati conservati a -80 ° C: lasciare che i vetrini di scongelare e asciugare a temperatura ambiente per 30 min. </li><li> Fissare i vetrini con il 10% formalina per 30 min a temperatura ambiente. </li><li> Lavare tre volte in PBS o tampone TBST, per ogni lavaggio immergere i vetrini per 10 volte in 250 ml di tampone. Tampone PBS può essere utilizzato per la colorazione di immunofluorescenza, tuttavia, per la rilevazione cromogenica con fosfatasi alcalina conjugated anticorpo, TBST deve essere utilizzato in quanto il fosfato in PBS inibisce l&#39;attività della fosfatasi alcalina. </li><li> Le sezioni di tessuto vetrini sono ora pronti per essere colorati. </li></ol> 4. Utilizzando Macchie istochimici come Alcian Blu e Schiff acido periodico per rilevare Muco <ol><li> Alcian Blu macchia: <ol><li> Sciacquarli con acqua, incubare in acido acetico al 3% per 3 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Macchia con Alcian blu pH 2,5 soluzione per 30 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Lavare i vetrini in acqua corrente per 10 minuti, sciacquare in acqua deionizzata. </li><li> Di contrasto in Nuclear Fast Red per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Lavare i vetrini tre volte in acqua deionizzata. </li></ol></li><li> Schiff acido periodico macchia: <ol><li> Sciacquarli con acqua, incubare in appena preparato acido periodico 1% per 5 min. </li><li> Lavare tre volte in acqua deionizzata, immergere in acqua una volta miliQ. </li><li> Colorare con il reagente di Schiff per 15 minuti a Temperatura ambientee. </li><li> Lavare i vetrini in acqua corrente per 10 minuti, sciacquare in acqua deionizzata. </li><li> Di contrasto in ematossilina Surgipath per 30 secondi a temperatura ambiente. </li><li> Lavare i vetrini tre volte in acqua deionizzata. </li><li> Incubare i vetrini 30 sec in acqua di rubinetto Scott a temperatura ambiente. </li><li> Lavare tre volte in acqua deionizzata. </li></ol></li><li> Disidratare e cancellare diapositive incubando 1 min in etanolo al 95%, seguita da tre rapidi cambi di etanolo al 100%, e tre variazioni Citrisolv, 2 minuti ciascuno. Il tutto a temperatura ambiente. </li><li> Montare i vetrini coprioggetto con il supporto resinoso (Cytoseal 60). </li></ol> 5. Utilizzo di lectine e anticorpi (Tabella 1) per rilevare epitopi glicano con i metodi istochimici <ol><li> Per la rivelazione della fluorescenza di tre epitopi glycan utilizzando lectine, bloccare i vetrini con 1% BSA in PBS per 10-30 min a temperatura ambiente. </li><li> Poiché una lectina biotinilato viene utilizzato, bloccare biotina endogena mediante incubazione 15 min con 0,1%Avidina, seguito da 15 minuti di incubazione con biotina 0,01% a temperatura ambiente. </li><li> Lavare i vetrini in PBS dopo ogni passaggio di blocco. </li><li> Appena preparare una miscela di 1 ug / ml rodamina coniugata agglutinina di germe di grano succinilata (sWGA), 1,3 mg / ml biotinilato Sambucus nigra agglutinina (SNA) e 5 pg / ml di fluoresceina coniugato Jacalin in HEPES / NaCl tampone (10 mM HEPES, 150 mM NaCl pH 7,5). </li><li> Collocare i vetrini su una superficie piana o in una scatola di colorazione, e la miscela di lectina strato sulla parte superiore. Il volume di miscela può essere ridotto leggermente posizionando parafilm sul liquido, il parafilm appiattisce il liquido e previene l&#39;evaporazione. </li><li> Incubare 1 ora a temperatura ambiente al buio. </li><li> Lavare i vetrini tre volte con PBS. </li><li> Vetrini strato con 0,7 ug / ml coniugato streptavidina-Cy5 (per rilevare la biotinilato-SNA), e incubare per 30 min a temperatura ambiente al buio. </li><li> Lavare i vetrini tre volte con PBS. </li><li> Controcolorare nuclei con 0.1 &amp; mu, g / ml DAPI. </li><li> Montare i vetrini coprioggetto con il mezzo acquoso come VectaMount mezzo di montaggio (o qualsiasi altro supporto acquosi). </li></ol> 6. Controllando per Specificità colorazione lectina <ol><li> Specificità colorazione lectina è controllato mediante clivaggio enzimatico specifico di bersaglio glicano epitopo prima della colorazione o da competizione con piccole molecole. </li><li> Clivaggio enzimatico per Sambucus nigra agglutinina (SNA) specificità di legame <ol><li> Diluire Arthrobacter ureafaciens sialidasi (AUS) a 250 mU / ml in 50 mM acetato di sodio pH 5.5. </li><li> Aggiungere acqua al fondo di un vuoto tip-box, questo formerà una camera umida durante l&#39;incubazione. </li><li> Collocare i vetrini a faccia in su nel vassoio superiore della punta-box, strato 150-200 ul di soluzione AUS sul vetrino e coprire con un vetrino coprioggetti. Evitare la formazione di bolle d&#39;aria. </li><li> Chiudere il coperchio della scatola e incubare a 37 ° C per 2,5 h. </li><li> Lavare i vetrini tre volte in PBS a temperare cameraratura per rimuovere tutti gli acidi liberi sialico. Queste diapositive dovrebbe essere negativo per la colorazione SNA. </li></ol></li><li> Inibitori competitivi per Jacalin succinilata e germe di grano agglutinina (sWGA) specificità <ol><li> Aliquotare 200 pl della miscela lectina preparato nella fase 5,4 a due flaconcini Eppendorf. </li><li> Aggiungere 200 mM melibiosio (inibitore Jacalin) ad una delle fiale e Chitin-idrolizzato a diluizione 1:10 (sWGA inibitore) alla fiala. </li><li> Vetrini di controllo negativi con l&#39;overlay contenente inibitori miscela e incubare 1 ora a temperatura ambiente al tempo stesso come il resto delle diapositive. Queste diapositive dovrebbe essere negativo per Jacalin o colorazione sWGA, rispettivamente. </li></ol></li></ol> 7. Risultati rappresentativi Un confronto tra i campioni di tessuto inclusi in paraffina di tessuti congelati incorporati in crio-protectant media (OCT) ha rivelato notevole differenza nella conservazione e la qualità della colorazione per Mucin glicoproteine. Colorazione dei tessuti con coloranti istochimiche, come Alcian Blu e acido periodico Schiff, producono risultati molto diversi in sezioni di tessuto comparabili da campioni congelati o incorporati paraffina (Figura 1). Sembra che il solvente organico (xilene o Citrisolv) che viene utilizzata durante il processo di paraffina influenza la distribuzione di mucine secrete sulla epiteli nonché eliminando gran parte dei glicolipidi dai campioni (Figura 2). Come risultato, lo strato di muco appare collassata sulle cellule della mucosa e si trova soprattutto nelle cellule caliciformi. Flash congelamento dei tessuti in crio-protectant supporti (OCT) ha mantenuto l&#39;idratazione del campione e conservato le dimensioni mucine strato secrete. Il processo di paraffina influenzata altre muco-glicani e glicolipidi associati in un modo simile. Distribuzione glicano stata esaminata usando lectine, che vengono abitualmente utilizzati per il rilevamento glicano (Figura 3) e anticorpi contro epitopi presenti sullamucine e glicolipidi (Figura 6). Perché lectina legante non è ben definito ed è influenzata dalla distribuzione spaziale dei glicani nonché la struttura glicano 14,15, è importante applicare gli opportuni controlli per la colorazione lectina. Qui mostriamo due metodi per controllare la colorazione lectina sui tessuti esaminati: scissione enzimatica e inibizione competitiva. Clivaggio degli epitopi glycan è stato fatto digerire con la sezione di tessuto glicano-specifici enzimi, per esempio sialidasi batteriche come controllo per l&#39;acido sialico vincolante SNA (Figura 4). Nei casi in cui l&#39;enzima specifico (ad esempio glicosidasi) non è disponibile per la rimozione del epitopo glicano studiato, lectina specificità può essere confermato con l&#39;aggiunta di un inibitore competitivo come melibiosio per colorazione Jacalin o Chitin-idrolizzato per la colorazione sWGA (Figura 5). Dimostriamo qui che snap-congelati campioni di tessuto, che sono routinely ottenuti in clinica e in laboratori di ricerca, può essere ulteriormente integrato in ottobre e utilizzati per studiare le glicoproteine ​​mucina e molti glicani presenti su di essi. <table border="1"><tbody><tr><td> Lectina / Ab </td><td> Fonte </td><td> Maggiore specificità </td></tr><tr><td> LFA </td><td> Limax flavus (slug Giallo) </td><td> Sia Terminal </td></tr><tr><td> MAA * </td><td> Maackia amurensis (Amur Maackia) </td><td> Siaα2-3Galβ1-R / 3-O-solfato sulle Galβ1-R </td></tr><tr><td> SNA </td><td> Sambucus nigra (Sambuco) </td><td> Siaα2-6Gal / Siaα2-6GalNAc </td></tr><tr><td> WGA </td><td> Triticum vulgaris (germe di grano) </td><td> GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc / Sia </td></tr><tr><td> sWGA </td><td> Triticum vulgaris succinilata (germe di grano) </td><td> GlcNAc &amp; beta, 1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc </td></tr><tr><td> PNA </td><td> Arachis hypogaea (arachidi) </td><td> Galβ1-3GalNAc (non modificato T-antigene) </td></tr><tr><td> Jacalin </td><td> Artocarpus integrifolia (Jacalin) </td><td> Galβ1-3GalNAc trovato su O-linked glicani </td></tr><tr><td> Corte dei conti </td><td> Erythrina cristagalli (albero corallo) </td><td> Galβ1-4GlcNAc </td></tr><tr><td> TKH2 </td><td> Anticorpo </td><td> Siaa2-6GalNAc (STN) su O-linked glicani </td></tr><tr><td> CA19-9 </td><td> Anticorpo </td><td> Siaa2-3Galβ1-4 (Fuca1-3) GlcNAc (SLE a) </td></tr><tr><td> SNH3 </td><td> Anticorpo </td><td> Siaa2-3Galβ1-3 (Fuca1-4) GlcNAc (SLE x) </td></tr></tbody></table> Abbreviazioni: Ab, anticorpi, Sia, acido sialico, Gal, galattosio, GalNAc, <em&gt; N-acetilgalattosammina; GlcNAc, N-acetilglucosamina, Fuc, Fucose, STN, sialil Tn, un SLE, sialil Lewisa, SLE x, x sialil Lewis. * Fonti commerciali per MAA sono MALI, MALII &amp; MAH. Tabella 1. Una lista parziale di lectine e anticorpi per epitopi glycan. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3928/3928fig1.jpg" /> Figura 1. Alcian Blu e Periodic Acid Schiff colorazione dei tessuti del colon congelati e inclusi in paraffina. Sezioni di tessuto di origine umana, mouse o campioni del colon pollo congelati in OCT (pannello superiore) o inclusi in paraffina (pannello inferiore) sono state colorate con acido periodico di Schiff (PAS) o Alcian blu (AB). Questi reagenti macchia di muco rosa o blu, rispettivamente. Pannello superiore: Nei tessuti congelati, oltre alle mucine in cellule caliciformi, muco secreto è stato anche neibile (frecce). Pannello inferiore: In tessuti inclusi in paraffina, colorazione muco si limitava a cellule caliciformi. I nuclei sono stati di contrasto con Surgipath (PAS) o di Mayer (AB) ematossilina. Bar Scala indichi 100 micron. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3928/3928fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3928/3928fig2.jpg" /> Figura 2. Risultati incubazione Citrisolv in perdita sostanziale di mucine. Sezioni seriali di campioni congelati ileo pollo sono state fissate in formalina tamponata al 10% e mantenuto idratato (pannello sinistro), disidratati in etanolo mediante incubazione sequenziale nel 70%, 90% e 100% etanolo per 20 min ciascuna (pannello centrale), o disidratati in etanolo ed eliminato con Citrisolv per 1 ora (pannello destro). Campioni disidratati sono stati reidratati torna alla PBS prima di ematossilina e eosina (H &amp; E) o Alcian colorazione blu. Etanolo disidratazione e Citrisolv compensazione migliore tessuto mormorfologia (ad esempio, riga superiore, le immagini al centro ea destra rispetto a immagine a sinistra). Disidratazione etanolo ha avuto alcun effetto significativo sulla colorazione Alcian blu (riga di mezzo, confrontare le immagini sinistra e al centro). In contrasto, l&#39;incubazione Citrisolv ridotto Alcian colorazione blu e confinato a cellule caliciformi (fila centrale, destro) in un modello che era simile a quella osservata nei tessuti inclusi in paraffina (Figura 1). Questi dati implicano che la colorazione forte di granuli di muco in inclusi in paraffina di campioni è dovuta alla contrazione e condensazione di muco nelle cellule calice durante la fase di compensazione. La colorazione più debole e meno denso di muco nelle congelati OTT-incorporati tessuti riflette una distribuzione più naturale di muco nel tessuto. Più elevati ingrandimenti delle aree in scatola sono contrassegnati con le frecce. Barre di scala indicano 50 pm (righe superiore e medio) e 10 micron (riga in basso). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3928/3928fig3.jpg" /> Figura 3. Il legame dilectine per epitopi glycan sui tessuti congelati e inclusi in paraffina. pollo piccolo intestino (ileo) campioni congelati in OCT (pannelli superiori) o inclusi in paraffina (pannelli inferiori) sono stati sondati con Jacalin (blu), sWGA (verde) e SNA (rosso ). Più elevati ingrandimenti delle aree in scatola sono contrassegnati con le frecce. Nei tessuti congelati legame O-linked glicani Jacalin rivelato strutture che sembravano essere trasudano dalle cellule calice nel lume (Jacalin, pannello superiore, frecce). Al contrario, vincolante per i tessuti inclusi in paraffina Jacalin si limitava a cellule caliciformi (Jacalin, pannello inferiore, frecce) e al confine pennello villi (in basso a sinistra dell&#39;immagine, freccia). colorazione sWGA di β1-4GlcNAc parzialmente co-localizzato con il legame della lectina Jacalin in entrambi i tessuti congelati (pannello superiore, frecce), e inclusi in paraffina tessuti (pannello inferiore, frecce). In contrasto, lectina SNA legame α2-6 acidi sialici collegati è intracellulare (SNA, frecce), e non co-localizza con Jacalin (coloreimmagine, SNA in rosso contrassegnato con punta di freccia, Jacalin in blu contrassegnata con la freccia tratteggiata). Barre di scala indicano 100 micron (immagini a sinistra) e 20 micron (ingrandite aree in scatola). <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3928/3928fig4.jpg" /> Figura 4. Controllo clivaggio enzimatico per colorazione acido sialico con SNA. Campioni intestino piccolo pollo sono state incubate con 250 mU / ml Arthrobacter ureafaciens sialidasi (AUS) o con 50 mM sodio acetato pH 5,5 tampone per 2,5 ore a 37 ° C. AUS trattamento abolisce colorazione con biotinilato SNA, confermando specificità di legame SNA agli acidi sialico. Bar Scala indica 100 micron. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3928/3928fig5.jpg" /> Figura 5. Controllo di inibizione competitiva per la colorazione glicano con Jacalin e sWGA. Pollo piccolo intestino (ileo) campioni sono stati incubati con una miscela Jacalin e sWGA in presenza di specifici lecInibitori stagno: melibiosio (colonna centrale), chitina-idrolizzato (colonna di destra) o senza inibitore (A e D). Pannello superiore: (a sinistra) colorazione Jacalin senza inibitori. (Al centro) colorazione Jacalin è stato inibito da melibiosio. (A destra) La chitina-idrolizzato non ha inibito la colorazione Jacalin. Pannello inferiore: (a sinistra) colorazione sWGA senza inibitore. (Al centro) melibiosio non ha inibito la colorazione sWGA. (A destra) colorazione sWGA è stato inibito da chitina-idrolizzato. Questo conferma l&#39;inibizione specifica interazione delle lectine con i tessuti. Asterischi immagine segno di inibizione colorazione. Bar Scala indica 100 micron. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/3928/3928fig6.jpg" /> Figura 6. Rilevamento di mucine secretori, glicolipidi e epitopi glycan congelati in tessuti umani di cancro del colon-retto. Biopsie di cancro del colon-retto da carcinoma dei villi e carcinoma muco erano snap-congelati in azoto liquido e integrato in ottobre Sezioni di tessuto sono state incubate per 1 hcon anticorpi contro la mucina secreta MUC5AC, sialil Lewis a - glicano epitopo trovato il gangliosidi (tumore colorettale marcatore CA 19-9), e sialil-Tn - abbondante epitopo glicano sulla mucine (rilevato con TKH2 anticorpo), seguito da 30 minuti di incubazione con asino biotinilato anti-IgG di topo anticorpo secondario, e 30 minuti di incubazione con streptavidina coniugata a perossidasi. Altri tessuti sono state incubate per 1 ora con l&#39;biotinilato lectine SNA e sWGA, seguiti da 30 minuti di incubazione con streptavidina coniugata a perossidasi. Colorazione con perossidasi è stato sviluppato utilizzando AEC kit. Barra della scala nera indica 200 micron.

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Conservazione di epitopi muco e glicano in tessuti congelati è superiore a quella dei tessuti che sono stati incorporati in paraffina. Abbiamo dimostrato la conservazione di strato di muco secreto (figure 1 e 3) e la distribuzione di tre strutture glicani (Figura 3) in tessuti congelati rispetto paraffinati tessuti. Fissativi specializzati, come soluzione di Carnoy (60% etanolo, 30% cloroformio, acido acetico 10%) 17 sono stati sviluppati per la conservazione ottimale dello strato di muco in campioni di tessuto. In modo ottimale, la soluzione dovrebbe essere utilizzato per raccogliere campioni di tessuto che sono dedicati per studi muco e ha dimostrato di mantenere l&#39;aspetto liscio strato di muco 16-17. Lo strato di muco non fissate in campioni congelati in OCT incorporato appare robusto e in alcune zone possono staccarsi dal tessuto, tuttavia lo spessore complessivo è in accordo con quello osservato nei tessuti che sono stati risolti con la soluzione di Carnoy e embedded in paraffina 16-17. Ad esempio, lo strato di muco congelate in sezione di tessuto umano del colon è ~ 100 um (Figura 1), che è all&#39;interno dell&#39;intervallo riportato per Carnoy&#39;s-campionamento fissa colon umano 55,4 ± 2,5 micron (range 7,7-204,8 micron) 16. E &#39;noto da decenni che risultati disidratazione in etanolo ~ restringimento 30% dei campioni biologici 18, e che i solventi organici come xilene, Citrisolv e cloroformio lipidi, glicolipidi e, in qualche misura, proteine ​​dai tessuti 13. Trasformazione dei tessuti per la paraffina comprende le seguenti fasi: fissazione (formalina tamponata al 10%), disidratazione (concentrazione di etanolo in aumento), e di compensazione (Citrisolv o xilene). Imitando questi passaggi non fissata sul sezioni di tessuto congelato, abbiamo dimostrato che Citrisolv estrae muco sezioni di tessuto congelato conseguente morfologia tissutale che è simile a quella di tessuti inclusi in paraffina (Figure 2, pannello di destra). Al contrario, lo strato di muco non è stato alterato mediante incubazione con formalina o etanolo (Figura 2, sinistra e pannelli centrali). Questo suggerisce che la fase di compensazione procedura standard paraffina, che richiede incubazione prolungata in Citrisolv / xilene, porta a collasso dello strato di muco. Fissazione in formalina non danneggia lo strato di muco e congelati sezioni tessuti che sono stati fissati in formalina può essere facilmente trattata con lectine e anticorpi contro glicani, glicolipidi e proteine ​​(figure 2, 3 e 6). Questi effetti possono essere trascurabile per lo studio delle proteine ​​di membrana e patologia dei tessuti, ma sono devastanti per strutture altamente idratati come lo strato di muco secreto. Tuttavia studi istologici di mucine sono ancora condotte principalmente con campioni inclusi in paraffina, in cui la conservazione strato di muco è subottimale. Nelle analisi approfondite di composizione dello strato di muco, come la precisa identità di sécreted o membrana combinazioni legate glicoproteina MUC richiedono anticorpi specifici e la spettrometria di massa per l&#39;identificazione delle proteine ​​dorsali. Preservazione dello strato di muco, ma è il requisito iniziale per tali studi. Molti laboratori hanno campioni di tessuti congelati in OCT che sono stati raccolti in passato per progetti diversi, questi tessuti possono essere facilmente utilizzato per studiare mucine, glicolipidi e distribuzione glicano eliminando la necessità di raccogliere tessuti in fissativi speciali che sono progettati unicamente per la conservazione muco. I tessuti congelati sottoposti a trattamento minimo e quindi la distribuzione naturale dei glicani, che sono idratati in natura, è conservata. Questo è particolarmente importante nel regno di interazioni ospite-microbica. La conoscenza della distribuzione naturalistica e l&#39;abbondanza di mucine secrete e le strutture glycan molti decorare questi &quot;barriera&quot; molecole sarà la chiave per comprendere difesa ospite, lo sfruttamento microbica e patogeniè.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente e </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> 2-metil butano </td><td> Fisher Scientific </td><td> 03551-4 </td></tr><tr><td> AEC perossidasi kit substrato </td><td> Vector Labs </td><td> SK-4200 </td></tr><tr><td> Alcian Blu </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A3157 </td></tr><tr><td> Anti-CA 19-9 anticorpo monoclonale </td><td> Calbiochem </td><td> CA1003 </td></tr><tr><td> Anti-MUC5AC anticorpo monoclonale </td><td> Millipore </td><td> MAB2011 </td></tr><tr><td> Avidina-biotina blocco kit </td><td> Vector Labs </td><td> SP-2001 </td></tr><tr><td> Biotinilato asino anti-topo </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 90863 </td></tr><tr><td> Biotinilato SNA </td><td> Vector Labs </td><td> B-1305 </td></tr><tr><td> Albumina di siero bovinomin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4503 </td></tr><tr><td> Chitina-idrolizzato </td><td> Vector Labs </td><td> SP-0090 </td></tr><tr><td> Criostato microtomo </td><td> Leica Microsystems </td><td> Leica CM 1800 </td></tr><tr><td> Ematossilina </td><td> Surgipath Medical Ind. </td><td> 3801570 </td></tr><tr><td> Il perossido di idrogeno 30% </td><td> Fisher Scientific </td><td> H325-100 </td></tr><tr><td> Jacalin-FITC </td><td> Vector Labs </td><td> FL-1151 </td></tr><tr><td> Ematossilina di Mayer </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> MHS32 </td></tr><tr><td> Melibiosio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M5500 </td></tr><tr><td> Nuclear Fast Red </td><td> Vector Labs </td><td> H-3403 </td></tr><tr><td> Ottobre composto </td><td> VWR International </td><td> 25608-930 </td></tr><tr><td> Perossidasi streptavidina coniugata </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 94638 </td></tr><tr><td> Schiff reagente </td><td> Scienze di microscopia elettronica </td><td> 26052 </td></tr><tr><td> sWGA-Rhodamine </td><td> Vector Labs </td><td> RL1022S </td></tr><tr><td> TKH2 anticorpo monoclonale </td><td> ATCC </td><td> HB-9654 </td></tr><tr><td> VectaMount mezzo di montaggio acquoso </td><td> Vector Labs </td><td> H-5501 </td></tr><tr><td> Cytoseal 60 </td><td> Thermo Scientific </td><td> 8310-4 </td></tr><tr><td> Peel-A Way stampi </td><td> Polysciences Inc. </td><td> 18646A-1 </td></tr></tbody></table>

using unfixed, frozen tissues to study natural mucin distribution

Mucine sono complesse e fortemente glicosilata O-linked glicoproteine, che contengono più del 70% in peso di carboidrati 1-3. Mucine secrete, prodotto dalle cellule caliciformi e della mucosa gastrica, forniscono l&#39;impalcatura per un micrometri di spessore strato di muco che le linee epiteliali dell&#39;intestino e del tratto respiratorio 3,4. Oltre a mucine, strati di muco contengono anche peptidi antimicrobici, citochine, e immunoglobuline 5-9. Lo strato di muco è una parte importante di immunità innata accoglienza, e costituisce la prima linea di difesa contro l&#39;invasione dei microrganismi 8,10-12. Come tale, il muco è soggetto a numerose interazioni con microbi, entrambi i patogeni e simbiotici, e mucine secrete costituiscono un&#39;importante interfaccia per queste interazioni. Lo studio di tali interazioni biologiche di solito comporta metodi istologici per la raccolta dei tessuti e colorazione. I due metodi più comunemente utilizzati per la raccolta dei tessuti istologici e Preservzione nella clinica e nei laboratori di ricerca sono: la fissazione in formalina seguita da paraffina, e il congelamento dei tessuti, seguita da incorporamento nel crio-protectant media. Incluso in paraffina di campioni di tessuto produrre sezioni con caratteristiche ottimali per la visualizzazione istologica tra cui la chiarezza e ben definita morfologia. Tuttavia, durante il processo di paraffina incorporare un numero di epitopi si alterano e per studiare questi epitopi, sezioni di tessuto devono essere ulteriormente trasformati con uno dei molti metodi smascheramento 13. Mucine secrete e lipidi vengono estratti dal tessuto durante la paraffina-embedding passo di compensazione, che richiede prolungare l&#39;incubazione con solventi organici (xilene o Citrisolv). Pertanto questo approccio è sub-ottimale per studi focalizzati sulla natura e la distribuzione di mucine e muco in vivo. Al contrario, i tessuti di congelamento a temperature di taglio ottimale (OCT) incorporando un supportovuoti disidratazione e di compensazione del campione, e mantiene l&#39;idratazione del campione. Questo permette una migliore conservazione del muco strato idratato, e consente quindi lo studio dei ruoli numerose mucine in biologia epiteliale. Poiché questo metodo richiede un trattamento minimo del tessuto, il tessuto viene mantenuto in uno stato più naturale. Pertanto sezioni congelate tessuti non richiedono alcuna ulteriore elaborazione prima della colorazione e può essere facilmente analizzati utilizzando metodi di immunoistochimica. Dimostriamo la conservazione di micrometri di spessore strato di muco secreto in campioni congelati colon. Questo strato viene drasticamente ridotta quando i tessuti stessi sono inclusi in paraffina. Abbiamo anche mostrare una colorazione immunofluorescenza di epitopi glycan presenti in mucine con lectine vegetali. Il vantaggio di questo approccio è che non richiede l&#39;uso di fissativi speciali e permette con tessuti congelati che possono già essere conservati in laboratorio.

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Using Unfixed, Frozen Tissues to Study Natural Mucin Distribution

Non fissati campioni di tessuto congelato incorporati nel terreno ottimale temperatura di taglio (OCT) possono essere utilizzati per studiare la distribuzione naturale e glicosilazione di muco secreto. In questa elaborazione tessuto approccio è minimo e la presentazione naturale di glicolipidi, mucine e glicano-epitopi è conservato. Le sezioni di tessuto possono essere analizzati mediante immunoistochimica con rivelatore a fluorescenza o cromogenico.

Utilizzo non fissati, tessuti congelati allo Studio di distribuzione naturale Mucina

Mucins are complex and heavily glycosylated O-linked glycoproteins, which contain more than 70% carbohydrate by weight1-3. Secreted mucins, produced by ...

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Research

JoVE Journal

Biology

47.5K Views.  University of California, San Diego. Non fissati campioni di tessuto congelato incorporati nel terreno ottimale temperatura di taglio (OCT) possono essere utilizzati per studiare la distribuzione naturale e glicosilazione di muco secreto. In questa elaborazione tessuto approccio è minimo e la presentazione naturale di glicolipidi, mucine e glicano-epitopi è conservato. Le sezioni di tessuto possono essere analizzati mediante immunoistochimica con rivelatore a fluorescenza o cromogenico.

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Testing Visual Sensitivity to the Speed and Direction of Motion in Lizards

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of the visual system provide more empirical evidence for functional applications. Investigation into the sensory system provides information about the sensory capacity, learning and memory ability, and establishes known baseline behaviour in which to gauge deviations (Burghardt, 1977). However, unlike mammalian or avian systems, testing for learning and memory in a reptile species is difficult. Furthermore, using an operant paradigm as a psychophysical measure of sensory ability is likewise as difficult. Historically, reptilian species have responded poorly to conditioning trials because of issues related to motivation, physiology, metabolism, and basic biological characteristics. Here, I demonstrate an operant paradigm used a novel model lizard species, the Jacky dragon (Amphibolurus muricatus) and describe how to test peripheral sensitivity to salient speed and motion characteristics. This method uses an innovative approach to assessing learning and sensory capacity in lizards. I employ the use of random-dot kinematograms (RDKs) to measure sensitivity to speed, and manipulate the level of signal strength by changing the proportion of dots moving in a coherent direction. RDKs do not represent a biologically meaningful stimulus, engages the visual system, and is a classic psychophysical tool used to measure sensitivity in humans and other animals. Here, RDKs are displayed to lizards using three video playback systems. Lizards are to select the direction (left or right) in which they perceive dots to be moving. Selection of the appropriate direction is reinforced by biologically important prey stimuli, simulated by computer-animated invertebrates.

Testing visual sensitivity in lizards using an operant conditioning paradigm that employs video playback of random-dot kinematograms and computer-generated invertebrates.

Test di sensibilità visiva alla velocità e direzione del movimento in lucertole

Testing visual sensitivity in any species provides basic information regarding behaviour, evolution, and ecology. However, testing specific features of ...

Ricerca

Biologia

Computer-Generated Animal Model Stimuli

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In particular, understanding the constraints on visual signal design for communication has been of great interest. Traditional methods for investigating animal interactions have used basic observational techniques, staged encounters, or physical manipulation of morphology. Less intrusive methods have tried to simulate conspecifics using crude playback tools, such as mirrors, still images, or models. As technology has become more advanced, video playback has emerged as another tool in which to examine visual communication (Rosenthal, 2000). However, to move one step further, the application of computer-animation now allows researchers to specifically isolate critical components necessary to elicit social responses from conspecifics, and manipulate these features to control interactions. Here, I provide detail on how to create an animation using the Jacky dragon as a model, but this process may be adaptable for other species. In building the animation, I elected to use Lightwave  3D to alter object morphology, add texture, install bones, and provide comparable weight shading that prevents exaggerated movement. The animation is then matched to select motor patterns to replicate critical movement features. Finally, the sequence must rendered into an individual clip for presentation. Although there are other adaptable techniques, this particular method had been demonstrated to be effective in eliciting both conspicuous and social responses in staged interactions.

Computer-generated stimuli using the Jacky dragon as a model.

Computer-Generated modello animale Stimoli

Communication between animals is diverse and complex. Animals may communicate using auditory, seismic, chemosensory, electrical, or visual signals. In ...

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish1-5. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adult zabrafish. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish with our simple custom-built apparatus using a new protocol which is established in our lab. Both our apparatus and step-by-step procedure of OKR in adult zebrafish are illustrated in this video. In addition, the measurements of the larval OKR, as well as the optomotor response (OMR) test of adult zebrafish, are also demonstrated in this video. This OKR assay of adult zebrafish in our experiment may last for up to 4 hours. Such OKR test applied in adult fish will benefit to visual function investigation more efficiently when the adult fish vision system is manipulated.
Su-Qi Zou and Wu Yin contributed equally to this paper.

Optokinetic response has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adults1-5. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish using a new protocol which is established in our lab.

Utilizzando la risposta optocinetico per studiare la funzione visiva del pesce zebra

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

Reverse Genetic Morpholino Approach Using Cardiac Ventricular Injection to Transfect Multiple Difficult-to-target Tissues in the Zebrafish Larva

The zebrafish is an important model to understand the cell and molecular biology of organ and appendage regeneration. However, molecular strategies to employ reverse genetics have not yet been adequately developed to assess gene function in regeneration or tissue homeostasis during larval stages after zebrafish embryogenesis, and several tissues within the zebrafish larva are difficult to target. Intraventricular injections of gene-specific morpholinos offer an alternative method for the current inability to genomically target zebrafish genes in a temporally controlled manner at these stages. This method allows for complete dispersion and subsequent incorporation of the morpholino into various tissues throughout the body, including structures that were formerly impossible to reach such as those in the larval caudal fin, a structure often used to noninvasively research tissue regeneration. Several genes activated during larval finfold regeneration are also present in regenerating adult vertebrate tissues, so the larva is a useful model to understand regeneration in adults. This morpholino dispersion method allows for the quick and easy identification of genes required for the regeneration of larval tissues as well as other physiological phenomena regulating tissue homeostasis after embryogenesis. Therefore, this delivery method provides a currently needed strategy for temporal control to the evaluation of gene function after embryogenesis.&#160;

An adaptable reverse genetic method for zebrafish to assess gene function during later stages of development and physiological homeostasis such as tissue regeneration using intraventricular injections of gene-specific morpholinos.

Reverse genetica Morpholino approccio Uso cardiaca ventricolare iniezione per transfettare diversi tessuti difficili da bersaglio in Zebrafish Larva

The zebrafish is an important model to understand the cell and molecular biology of organ and appendage regeneration. However, molecular strategies to ...

High-throughput Image Analysis of Tumor Spheroids: A User-friendly Software Application to Measure the Size of Spheroids Automatically and Accurately

The increasing number of applications of three-dimensional (3D) tumor spheroids as an in vitro model for drug discovery requires their adaptation to large-scale screening formats in every step of a drug screen, including large-scale image analysis. Currently there is no ready-to-use and free image analysis software to meet this large-scale format. Most existing methods involve manually drawing the length and width of the imaged 3D spheroids, which is a tedious and time-consuming process. This study presents a high-throughput image analysis software application &#8211; SpheroidSizer, which measures the major and minor axial length of the imaged 3D tumor spheroids automatically and accurately; calculates the volume of each individual 3D tumor spheroid; then outputs the results in two different forms in spreadsheets for easy manipulations in the subsequent data analysis. The main advantage of this software is its powerful image analysis application that is adapted for large numbers of images. It provides high-throughput computation and quality-control workflow. The estimated time to process 1,000 images is about 15 min&#160;on a minimally configured laptop, or around 1 min&#160;on a multi-core performance workstation. The graphical user interface (GUI) is also designed for easy quality control, and users can manually override the computer results. The key method used in this software is adapted from the active contour algorithm, also known as Snakes, which is especially suitable for images with uneven illumination and noisy background that often plagues automated imaging processing in high-throughput screens. The complimentary &#8220;Manual Initialize&#8221; and &#8220;Hand Draw&#8221; tools provide the flexibility to SpheroidSizer in dealing with various types of spheroids and diverse quality images. This high-throughput image analysis software remarkably reduces labor and speeds up the analysis process. Implementing this software is beneficial for 3D tumor spheroids to become a routine in vitro model for drug screens in industry and academia.

We present a high-throughput image analysis software application to measure the size of three-dimensional tumor spheroids imaged with bright-field microscopy. This application provides a fast and effective way to examine the effects of therapeutic drugs on spheroids, which is beneficial for researchers who wish to use spheroids in drug screens.

High-throughput Immagine Analisi di sferoidi tumorali: Un software applicativo di facile utilizzo per misurare le dimensioni del Spheroids automaticamente e con precisione

The increasing number of applications of three-dimensional (3D) tumor spheroids as an in vitro model for drug discovery requires their adaptation to ...

Using Mouse Mammary Tumor Cells to Teach Core Biology Concepts: A Simple Lab Module

Undergraduate biology students are required to learn, understand and apply a variety of cellular and molecular biology concepts and techniques in preparation for biomedical, graduate and professional programs or careers in science. To address this, a simple laboratory module was devised to teach the concepts of cell division, cellular communication and cancer through the application of animal cell culture techniques. Here the mouse mammary tumor (MMT) cell line is used to model for breast cancer. Students learn to grow and characterize these animal cells in culture and test the effects of traditional and non-traditional chemotherapy agents on cell proliferation. Specifically, students determine the optimal cell concentration for plating and growing cells, learn how to prepare and dilute drug solutions, identify the best dosage and treatment time course of the antiproliferative agents, and ascertain the rate of cell death in response to various treatments. The module employs both a standard cell counting technique using a hemocytometer and a novel cell counting method using microscopy software. The experimental procedure lends to open-ended inquiry as students can modify critical steps of the protocol, including testing homeopathic agents and over-the-counter drugs. In short, this lab module requires students to use the scientific process to apply their knowledge of the cell cycle, cellular signaling pathways, cancer and modes of treatment, all while developing an array of laboratory skills including cell culture and analysis of experimental data not routinely taught in the undergraduate classroom.

A feasible laboratory module for biology undergraduates that explores advanced cellular and molecular concepts using animal cell culture is described. Students grow, characterize and manipulate a breast cancer cell model by exposure to chemotherapy agents. Cell viability is assayed through cell counting using both a standard and novel method.

Utilizzando il mouse cellule tumorali mammarie per insegnare concetti di biologia di base: un modulo di laboratorio semplice

Undergraduate biology students are required to learn, understand and apply a variety of cellular and molecular biology concepts and techniques in ...

Using Caco-2 Cells to Study Lipid Transport by the Intestine

Studies of dietary fat absorption are generally conducted by using an animal model equipped with a lymph cannula. Although this animal model is widely accepted as the in vivo model of dietary fat absorption, the surgical techniques involved are challenging and expensive. Genetic manipulation of the animal model is also costly and time consuming. The alternative in vitro model is arguably more affordable, timesaving, and less challenging. Importantly, the in vitro model allows investigators to examine the enterocytes as an isolated system, reducing the complexity inherent in the whole organism model. This paper describes how human colon carcinoma cells (Caco-2) can serve as an in vitro model to study the enterocyte transport of lipids, and lipid-soluble drugs and vitamins. It explains the proper maintenance of Caco-2 cells and the preparation of their lipid mixture; and it further discusses the valuable option of using the permeable membrane system. Since differentiated Caco-2 cells are polarized, the main advantage of using the permeable membrane system is that it separates the apical from the basolateral compartment. Consequently, the lipid mixture can be added to the apical compartment while the lipoproteins can be collected from the basolateral compartment. In addition, the effectiveness of the lentivirus expression system in upregulating gene expression in Caco-2 cells is discussed. Lastly, this paper describes how to confirm the successful isolation of intestinal lipoproteins by transmission electron microscopy (TEM).

Caco-2 cells can serve as an in vitro model to study the enterocyte transport of lipids, and lipid-soluble drugs/vitamins. The permeable membrane system separates the apical from the basolateral compartment, while the lentivirus expression system offers an effective gene overexpression method. The isolation of lipoproteins is confirmed by TEM.

Utilizzando cellule Caco-2 allo Studio Lipid Trasporto dall&#39;intestino

Studies of dietary fat absorption are generally conducted by using an animal model equipped with a lymph cannula. Although this animal model is widely ...

Mucin Agarose Gel Electrophoresis: Western Blotting for High-molecular-weight Glycoproteins

Mucins, the heavily-glycosylated proteins lining mucosal surfaces, have evolved as a key component of innate defense by protecting the epithelium against invading pathogens. The main role of these macromolecules is to facilitate particle trapping and clearance while promoting lubrication of the mucosa. During protein synthesis, mucins undergo intense O-glycosylation and multimerization, which dramatically increase the mass and size of these molecules. These post-translational modifications are critical for the viscoelastic properties of mucus. As a result of the complex biochemical and biophysical nature of these molecules, working with mucins provides many challenges that cannot be overcome by conventional protein analysis methods. For instance, their high-molecular-weight prevents electrophoretic migration via regular polyacrylamide gels and their sticky nature causes adhesion to experimental tubing. However, investigating the role of mucins in health (e.g., maintaining mucosal integrity) and disease (e.g., hyperconcentration, mucostasis, cancer) has recently gained interest and mucins are being investigated as a therapeutic target. A better understanding of the production and function of mucin macromolecules may lead to novel pharmaceutical approaches, e.g., inhibitors of mucin granule exocytosis and/or mucolytic agents. Therefore, consistent and reliable protocols to investigate mucin biology are critical for scientific advancement. Here, we describe conventional methods to separate mucin macromolecules by electrophoresis using an agarose gel, transfer protein into nitrocellulose membrane, and detect signal with mucin-specific antibodies as well as infrared fluorescent gel reader. These techniques are widely applicable to determine mucin quantitation, multimerization and to test the effects of pharmacological compounds on mucins.

Mucins are high-molecular-weight glycoconjugates, with size ranging from 0.2 to 200 megadalton (MDa). As a result of their size, mucins do not penetrate conventional polyacrylamide gels and require larger pores for separation. We provide a detailed protocol for mucin agarose gel electrophoresis to assess relative quantification and study polymer assembly.

Mucina Agarosio elettroforesi su gel: Western Blotting per glicoproteine ​​ad alto peso molecolare


Mucins, the heavily-glycosylated proteins lining mucosal surfaces, have evolved as a key component of innate defense by protecting the epithelium against ...

Deploying Community Scientists to Conduct Nondestructive Genetic Sampling of Rare Butterfly Populations

Global insect declines continue to accelerate. Effective genetic sampling is critically needed to advance the understanding of many taxa and address existing knowledge gaps. This protocol represents a demonstrated method for nondestructively sampling rare butterflies for population genetic structure or DNA barcoding analyses. It uses the chorion of hatched butterfly ovae to yield sufficiently high quantity and quality DNA for successful gene sequencing to confirm species identity and quantify genetic variation. It may be particularly useful when other tissue sampling techniques are impractical or unavailable. While developed for a lepidopteran, it nonetheless could easily be adapted for use with other insect species. It was specifically designed with ease of use as a goal to help maximize broad implementation by individuals of varying experience and skill levels, such as community scientists, conservation practitioners, and students, and for use over large geographic areas to facilitate broad population sampling. The data generated can help inform taxonomic and listing decisions, conservation and management actions, and enhance basic ecological research.

Here, we present a straightforward protocol for noninvasive genetic sampling of butterfly populations based on the field collection of residual egg debris. It can be used to confirm species identity and quantify genetic variation. This protocol can be easily adapted to broader groups for community science involvement.

Impiego di scienziati della comunità per condurre campionamenti genetici non distruttivi di rare popolazioni di farfalle

Global insect declines continue to accelerate. Effective genetic sampling is critically needed to advance the understanding of many taxa and address ...

Isolamento e profilazione di singoli nuclei da tessuti di mammiferi congelati

A Simple, Quick, and Partially Automated Protocol for the Isolation of Single Nuclei from Frozen Mammalian Tissues for Single Nucleus Sequencing

Single-cell and single-nucleus RNA sequencing have become common laboratory applications due to the wealth of transcriptomic information that they provide. Single nucleus RNA sequencing, particularly, is useful for investigating gene expression in difficult-to-dissociate tissues. Furthermore, this approach is also compatible with frozen (archival) material. Here, we describe a protocol to isolate high-quality single nuclei from frozen mammalian tissues for downstream single nucleus RNA sequencing in a partially-automated manner using commercially available instruments and reagents. Specifically, a robotic dissociator is used to automate and standardize tissue homogenization, followed by an optimized chemical gradient to filter the nuclei. Lastly, we accurately and automatically count the nuclei using an automated fluorescent cell counter. The performance of this protocol is demonstrated on mouse brain, rat kidney, and cynomolgus liver and spleen tissue. This protocol is straightforward, rapid, and readily adaptable to various mammalian tissues without requiring extensive optimization and provides good quality nuclei for downstream single nuclei RNA sequencing.

Autore in primo piano: Migliorare la scoperta di farmaci - Sviluppo di protocolli automatizzati e standardizzati per l'estrazione di nuclei da tessuti congelati 

The study describes a simple, quick, and partially automated protocol to isolate high-quality nuclei from frozen mammalian tissues for downstream single nuclei RNA sequencing.

Un protocollo semplice, rapido e parzialmente automatizzato per l'isolamento di singoli nuclei da tessuti di mammiferi congelati per il sequenziamento di singoli nuclei