Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni NIH / NIAAA (AA11852 e AA007471).

<ol>
	<li>Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survivable+stereotaxic+surgery+in+rodents.">Survivable stereotaxic surgery in rodents.</a> J. Vis. Exp. (20), e880 (2008).</li><li>Howard, E. C., Schier, C. J., Wetzel, J. S., Gonzales, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dopamine+response+in+the+nucleus+accumbens+core-shell+border+differs+from+that+in+the+core+and+shell+during+operant+ethanol+self-administration.">The dopamine response in the nucleus accumbens core-shell border differs from that in the core and shell during operant ethanol self-administration.</a> Alcohol Clin. Exp. Res. 33, 1355-1365 (2009).</li><li>Doyon, W. M., York, J. L., Diaz, L. M., Samson, H. H., Czachowski, C. L., Gonzales, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+activity+in+the+nucleus+accumbens+during+consummatory+phases+of+oral+ethanol+self-administration.">Dopamine activity in the nucleus accumbens during consummatory phases of oral ethanol self-administration.</a> Alcohol Clin. Exp. Res. 27, 1573-1582 (2003).</li><li>Pettit, H. O., Justice, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+dose+on+cocaine+self-administration+behavior+and+dopamine+levels+in+the+nucleus+accumbens.">Effect of dose on cocaine self-administration behavior and dopamine levels in the nucleus accumbens.</a> Brain Res. 539, 94-102 (1991).</li><li>Paxinos, G., Kus, L., Ashwell, K. W. S., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chemoarchitectonic Atlas of The Rat Forebrain. , (1998).</li><li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , (1986).</li><li>Skoog, D. A., Holler, F. J., Nieman, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of Instrumental Analysis. , (1998).</li><li>Doyon, W. M., Anders, S. K., Ramachandra, V. S., Czachowski, C. L., Gonzales, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+operant+self-administration+of+10%+ethanol+plus+10%+sucrose+on+dopamine+and+ethanol+concentrations+in+the+nucleus+accumbens.">Effect of operant self-administration of 10% ethanol plus 10% sucrose on dopamine and ethanol concentrations in the nucleus accumbens.</a> J Neurochem. 93, 1469-1481 (2005).</li><li>Carrillo, J., Gonzales, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+exposure+to+voluntary+ethanol+self-administration+produces+adaptations+in+ethanol+consumption+and+accumbal+dopamine+signaling.">A single exposure to voluntary ethanol self-administration produces adaptations in ethanol consumption and accumbal dopamine signaling.</a> Alcohol. 45, 559-5566 (2011).</li><li>Howard, E. C., Schier, C. J., Wetzel, J. S., Duvauchelle, C. L., Gonzales, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+shell+of+the+nucleus+accumbens+has+a+higher+dopamine+response+compared+with+the+core+after+non-contingent+intravenous+ethanol+administration.">The shell of the nucleus accumbens has a higher dopamine response compared with the core after non-contingent intravenous ethanol administration.</a> Neuroscience. 154, 1042-1053 (2008).</li><li>Robinson, D. L., Lara, J. A., Brunner, L. J., Gonzales, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Ethanol+Concentrations+in+the+Extracellular+Fluid+of+the+Rat+Brain.">Quantification of Ethanol Concentrations in the Extracellular Fluid of the Rat Brain.</a> J. Neurochem. 75, 1685-1693 (2000).</li><li>Gonzales, R. A., McNabb, J., Yim, H. J., Ripley, T., Bungay, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Microdialysis+of+Ethanol+in+Rat+Striatum.">Quantitative Microdialysis of Ethanol in Rat Striatum.</a> Alcohol Clin. Exp. Res. 22, 858-867 (1998).</li></ol>

Questo articolo è stato finanziato dal Med Associates, Inc.

Applicazioni e limitazioni Droga auto-amministrazione è utilizzato in roditori a dipendenza del modello di droga. Molti farmaci di abuso che sono modellate in questo modo può essere somministrato per via endovenosa, in cui il farmaco viene consegnato direttamente al vano centrale. Questo consente un attento monitoraggio della dose per un auto-amministrazione sessione. Dal momento che l&#39;etanolo è di solito auto-somministrato per via orale, è molto più difficile di monitorare i livelli di farmaco a causa di differenze individuali di assorbimento e il metabolismo. Utilizzando microdialisi a campione dalla regione del cervello di interesse, non sono in grado di controllare il modello di etanolo raggiungere la regione, ma siamo anche in grado di monitorare simultaneamente i cambiamenti dei neurotrasmettitori nella stessa regione nel corso del tempo durante ogni fase di auto-somministrazione. Alterazioni neurochimiche indotte da farmaci e le risposte del cervello sono associati con abuso e di dipendenza, quindi, la possibilità di concomitanza MEAneurochimico che concentrazioni del farmaco nel corso di specifiche fasi di auto-amministrazione fornisce uno strumento molto potente e unico. Una questione da tenere a mente per correlare le concentrazioni di analiti con dialisato comportamento è le caratteristiche fisiche del l&#39;impianto idraulico microdialisi. Specificamente, il tempo necessario per il fluido da trasferire dal lume della sonda microdialisi al tubo di raccolta è critica, e riducendo i tempi sono migliori. Nel nostro laboratorio, costruiamo le sonde in modo che il tempo è di circa 90 secondi. Utilizzando queste condizioni, abbiamo scoperto che vi è un aumento della dopamina accumbal all&#39;inizio del consumo di etanolo, che diminuisce nel corso dei periodi bevande e post-bevanda al crescere dialisato concentrazione di etanolo. 2,3,8,9 Questi esperimenti , in combinazione con i dati provenienti da studi farmacologici, ci hanno permesso di analizzare gli effetti strettamente farmacologici di etanolo e di auto-somministrazione associati stimoli ambientali sul canaleanges delle concentrazioni di neurotrasmettitori. Va notato che questa particolare applicazione del combinato comportamentale-microdialisi tecniche è adatto agli attuali interessi di ricerca del nostro laboratorio. È stato progettato per valutare il pattern temporale di etanolo che raggiunge il cervello in confronto al modello di cambiamenti dei neurotrasmettitori nella stessa regione, in modo da poter collegare queste misure sincroni auto-amministrazione comportamenti. I derivati ​​concentrazioni di etanolo dialisato non sono corretti per il recupero della sonda in vivo, e sono solo una frazione della concentrazione di etanolo tessuto cerebrale. Se microdialisi quantitativa di etanolo è richiesto, la frazione di estrazione di etanolo che diffonde dallo spazio extracellulare nella sonda deve essere determinato sperimentalmente. Vedere pubblicazioni precedenti del nostro laboratorio per i metodi e le ulteriori discussioni. 10,11,12 Sebbene questo protocollo illustra l&#39;uso di gas chromatography con microestrazione in fase solida di etanolo dallo spazio di testa dei campioni di microdialisi, altri metodi per l&#39;analisi del contenuto di etanolo nel campione microdialisi potrebbe essere utilizzato. Tuttavia, metodi alternativi possono soffrire di alcuni svantaggi. Ad esempio, i metodi di analisi meno sensibili possono richiedere un volume di campione più ampio che necessita di tempi di campionamento superiore al 5-7 minuti qui illustrato. Il tipo di sistema discusso qui usa un microestrazione in fase solida che concentra l&#39;etanolo nella fase vapore nella fiala campione sigillato, consentendo l&#39;assorbimento alla fibra collocato nello spazio di testa flaconcino. Questo migliora il limite di rilevazione rispetto campionamento headspace diretta che consente tipicamente 50-100 microlitri del vapore da iniettare. Un altro grande vantaggio del metodo è che spazio di testa del campione iniettato per analisi è estremamente pulita e priva di sali. Iniezione diretta del campione microdialisi liquido può essere utilizzato anche con maggiore SENsitivity, ma ciò richiederà più tempo strumento verso il basso a causa di manutenzione ordinaria necessaria per pulire i sali iniettati. Risoluzione dei problemi e altre note <ol><li> Prima che l&#39;esperimento ha inizio, concedetevi un po &#39;di tempo per verificare che i microdialisi set-up corretto funzionamento e per problemi sparare eventuali problemi. Si consiglia di avere un extra set-up, perfusi con ACSF, pronti a passare con un malfunzionamento set-up per risparmiare tempo, in quanto la maggior parte delle sessioni operante tendono a manifestarsi in un momento specifico ogni giorno. </li><li> Assicurarsi che le sonde da microdialisi sono inseriti in un periodo di circa 5 min per minimizzare il danno ai tessuti prodotti da taglio del tessuto, come la sonda penetra il cervello. </li><li> Durante il trasferimento del ratto nella camera operante è utile avere una seconda persona assistere in modo che la linea di trasferimento (parte della microdialisi set-up) non diventa aggrovigliato, e in modo che il programma può essere operante initIATED in tempo. </li><li> Assicurarsi che vi darà l&#39;abbondanza di acqua campionatore bagno di tempo per raggiungere la temperatura adeguata. Il nostro sistema richiede in genere due ore per raggiungere i 50 ° C. Inoltre, assicurarsi che i campioni siano completamente vaporizzato prima di analizzare i campioni. Noi di solito visivamente confermare che questo si è verificato prima di iniziare l&#39;analisi dei campioni. </li><li> Standard di buone pratiche di chimica analitica devono essere seguite. Questi includono, ma non sono limitati a, convalida di individui, attrezzature e procedure. In breve, si impiegano le seguenti linee guida: i singoli utenti devono dimostrare la capacità di generare riproducibili i valori di altezza di picco per le concentrazioni di standard e lineari curve standard (R2 ≥ 0,99) nell&#39;arco di più giorni. Per verificare la GC-FID sistema funziona correttamente, le norme devono essere sempre essere analizzati prima di qualsiasi campione dializzato vengono iniettati. La curva standard generata deve avere un R2 ≥ 0,99. </li><li> La maggior parte delle apparecchiature che utilizzanoè stato acquistato attraverso Varian, Inc., che è stata acquisita da Agilent Technologies nel 2010. In questo momento, Bruker Strumenti scientifici ottenuti Varian laboratorio di gascromatografia affari strumenti. Per gli acquisti futuri, consultare entrambe le società. </li><li> Il protocollo attuale mostra un comportamento operante con i ratti, ma lo spettatore deve essere consapevole che più interruzioni di comportamento è probabile che si verificano con il modello più piccolo topo. Un altro aspetto da considerare è che l&#39;inserimento di una sonda da microdialisi in altre regioni del cervello che la corteccia prefrontale mediale e nucleo accumbens può interrompere un comportamento operante in misura maggiore rispetto a quanto mostrato qui. E &#39;importante esaminare attentamente numerosi parametri comportamentali per determinare se il danno causato dal posizionamento della sonda produce gravi alterazioni nel comportamento. </li></ol>

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> 95% etanolo </td><td> AAPER alcool e Chemical Co., Shelbyville, KY </td><td> E190, 111000190 </td></tr><tr><td> Ultra-Pure Saccarosio </td><td> MP Biomedicals, LLC, Solon, OH </td><td> 821721 </td></tr><tr><td> Ultra High Purity elio </td><td> Air Gas </td><td> HE UHP300 </td></tr><tr><td> Aria </td><td> Air Gas </td><td> AIZ300 </td></tr><tr><td> Idrogeno </td><td> Air Gas </td><td> AIZ300 </td></tr><tr><td> GC 2 ml fiale </td><td> Agilent </td><td> # 8010-0015 </td></tr><tr><td> Tappi delle fiale GC con PTFE / silicone setti </td><td> Agilent </td><td> 8010-0084 # </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Reagenti specifici

microdialysis of ethanol during operant ethanol self-administration and ethanol determination by gas chromatography

Operante auto-somministrazione metodi sono comunemente usati per studiare gli effetti comportamentali e farmacologici di molti farmaci di abuso, tra cui l&#39;etanolo. Tuttavia, l&#39;etanolo è in genere auto-somministrato per via orale, piuttosto che per via endovenosa come molte altre sostanze d&#39;abuso. La farmacocinetica dei farmaci somministrati per via orale sono più complesse di farmaci somministrati per via endovenosa. Poiché la comprensione del rapporto tra gli effetti farmacologici e comportamentali di etanolo richiede la conoscenza dell&#39;andamento nel tempo di etanolo raggiunge il cervello durante e dopo bere, usiamo microdialisi in vivo e gascromatografia con rivelatore a ionizzazione di fiamma per monitorare cerebrali concentrazioni di etanolo dialisato nel tempo. Combinati microdialisi-comportamentali esperimenti comportano l&#39;uso di tecniche diverse. In questo articolo, chirurgia stereotassica, formazione comportamentale e microdialisi, che può essere adattato per testare una moltitudine di auto-somministrazione e neupetrolchimico ipotesi centrato, sono inclusi solo per illustrare il loro rapporto con le successive fasi di raccolta dei campioni e analisi di etanolo dialisato. Dializzato concentrazione di etanolo analisi tramite gascromatografia con rivelazione a ionizzazione di fiamma, che è specifico per studi etanolo, è descritto in dettaglio. I dati prodotti da questi metodi di rivelare il disegno di etanolo che raggiunge il cervello durante la procedura di auto-amministrazione, e se abbinato con l&#39;analisi neurochimica dei campioni dialisato stessi, permette di trarre conclusioni circa gli effetti farmacologici e comportamentali di etanolo.

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Microdialysis of Ethanol During Operant Ethanol Self-administration and Ethanol Determination by Gas Chromatography

Un metodo per determinare l&#39;andamento nel tempo della concentrazione di etanolo nel cervello di ratti durante etanolo operante autosomministrazione viene descritto. Gascromatografia con rivelazione a ionizzazione di fiamma viene utilizzato per quantificare etanolo nei campioni di dialisato, perché ha la sensibilità richiesta per i piccoli volumi generati.

Microdialisi di etanolo durante la determinazione operante auto-amministrazione ed etanolo etanolo mediante gascromatografia

Operant self-administration methods are commonly used to study the behavioral and pharmacological effects of many drugs of abuse, including ethanol.  ...

microdialysis-ethanol-during-operant-ethanol-self-administration

Research

JoVE Journal

Neuroscience

17.4K Views.  The University of Texas at Austin. Un metodo per determinare l'andamento nel tempo della concentrazione di etanolo nel cervello di ratti durante etanolo operante autosomministrazione viene descritto. Gascromatografia con rivelazione a ionizzazione di fiamma viene utilizzato per quantificare etanolo nei campioni di dialisato, perché ha la sensibilità richiesta per i piccoli volumi generati.