Ringraziamo il Dott. Christophe Masselon (IRTV, CEA, Grenoble) e membri della infezione virale e del Gruppo Cancro alla IBS, per la loro valutazione critica del manoscritto e per le discussioni utili. Siamo grati a Cyril Dian per il gentile dono della proteina CRM1. Questo lavoro scientifico si è svolto nella struttura spettrometria di massa del Centre Grenoble Istruire (ISBG; UMS 3518 CNRS-CEA-UJF-EMBL). E &#39;stato sostenuto finanziariamente dal Infrastructure francese per Integrated Structural Biology Initiative (FRISBI, ANR-10-InSb-05-02), GRAL (ANR-10-labx-49-01) [nell&#39;ambito del Partenariato per la biologia strutturale di Grenoble] e il Centro nazionale francese per la ricerca scientifica (CNRS).

1. Preparazione Protein Sample: Buffer Exchange (opzionale) 5-25 microlitri di concentrazioni micromolari di proteine ​​(1 a 20 mM) sono necessari. Scambio buffer può essere effettuata utilizzando dispositivi di ultrafiltrazione centrifuga (ad esempio Vivaspin, Sartorius) o colonne di filtrazione gel microcentrifuga (ad esempio, Micro Bio-Spin 6 colonne per cromatografia, Bio-Rad) 29,30. Procedura di cambio Buffer possono essere ripetuti 2-3x. Descrizione dettagliata dello scambio di buffer è stato precedentemente presentato 29,30. Ad esempio, utilizziamo tris 20 mm (idrossimetil) aminometano (cioè Tris) pH 8 come buffer di finale. Nota: Questo passaggio potrebbe essere omesso in molti casi. Dovrebbe essere eseguita quando un campione proteina contiene molecole o buffer che potrebbe fortemente interferire con MS rilevamento [es glicerolo, 4 - (2-idrossietil)-1-piperazineethanesulfonic acido, HEPES]. E &#39;anche utile per migliorare la qunalità degli spettri. 2. Recrystallization di matrici al fine di migliorare la loro purezza (facoltativo) <ol><li> Versare 10 ml di 40% etanolo (EtOH) in un pallone Pyrex. </li><li> Aggiungere 600 mg di una matrice. </li><li> Utilizzando un bagno di acqua e un riscaldatore a resistenza, riscaldare la soluzione di matrice e mescolate finché la matrice è completamente sciolto con una bacchetta di vetro o un agitatore magnetico. </li><li> Ripetere il passo 2 fino ad ottenere una soluzione satura. </li></ol> Nota: Utilizzando un eccessivo volume di solvente o sciogliere la matrice di sotto del punto di ebollizione della soluzione provoca una scarsa resa di cristalli o cristalli di affatto. <ol start="5"><li> Lasciare che la soluzione raffreddare lentamente. Si può lasciarla a temperatura ambiente per diverse ore e poi a 4 ° C durante la notte. Nota: se non si formano cristalli, la cristallizzazione può essere indotta da graffiare l&#39;interno del bicchiere (appena sotto la superficie della soluzione) con una bacchetta di vetro. </li><li> Raccogliere i cristalli della matrice per filtrazione. </li><li> Risciacquare i cristalli con una quantità minima di solvente ghiacciata e filtrato. </li><li> Lasciare i cristalli asciugare. Potete usare il vuoto per questo passo. </li></ol> 3. Pulizia di MALDI acciaio inossidabile di destinazione <ol><li> Sciacquare la piastra MALDI con metanolo (MeOH) e strofinare delicatamente con un panno di pulizia appositamente per applicazioni di laboratorio (ad es Kimwipe). </li><li> Sciacquare il bersaglio con H 2 O e pulirla con un panno di pulizia. </li><li> Inserire la piastra MALDI in un becher da 600 ml e coprire con il 50% EtOH. </li><li> Sonicare la porta nella soluzione EtOH per 10 minuti in un bagno ad ultrasuoni. </li><li> Se ci sono residui rimasti sul piatto, ripetere i passaggi 1-4, ancora una volta. </li><li> Infine, risciacquare il bersaglio con MeOH (o con acqua, la nota seguente), inclinarlo in un modo che è raccolto tutto il liquido su un tessuto di pulizia. Lasciare la porta a secco a temperatura ambiente o con un azotoflusso di gas. </li></ol> Nota: Una procedura simile è stato descritto in precedenza 15. Nota: Il solvente (metanolo o acqua) utilizzati per l&#39;ultimo risciacquo del bersaglio determina alcune caratteristiche bersaglio. Se il bersaglio viene risciacquata con MeOH, il campione si sparga sul bersaglio molto più di quando si usa acqua. 4. α-CHCA sottile strato Soluzione: Preparazione e Deposizione sul target MALDI <ol><li> Sciogliere α-CHCA in acetone per ottenere una soluzione satura. </li><li> A mano (senza pipetta) immergere un microlitri punta 10 (ad esempio GELoader Tip, Eppendorf) in α-CHCA soluzione satura: una piccola quantità della soluzione fluirà nella punta (per capillarità). </li><li> Toccare molto rapidamente (ossia 1 sec) il target MALDI con puntale e depositare la soluzione di acetone α-CHCA sul target MALDI. Questo costituirà lo strato sottile matrice, dove la proteinacampione sarà depositato. Prova a generare un punto strato sottile il più piccolo possibile. </li></ol> Nota: Quando si utilizza SA come matrice, prepariamo uno strato sottile con una soluzione satura di SA in acetone. 5. Preparazione di Natrix Solutions: SA, α-CHCA, DHB e CHCA_DHB Miscela 25 <ol><li> Preparare una soluzione di 20 mg / ml SA in ACN, 0,1% TFA (70:30, vol / vol). </li><li> Preparare 20 mg / ml soluzione α-CHCA in ACN e il 5% di acido formico (70:30, vol / vol) [chiamato come &quot;soluzione di α-CHCA&quot;]. </li><li> Preparare una / soluzione DHB ml 20 mg in ACN e acido 0,1% trifluoroacetico (TFA) (70:30, vol / vol) [chiamato come &quot;soluzione DHB&quot;]. </li><li> Mix &quot;soluzione α-CHCA&quot; e &quot;soluzione DHB&quot; in rapporto 1:1 (vol / vol), per ottenere la &quot;soluzione CHCA_DHB&quot;. </li></ol> Nota: Si può mescolare &quot;soluzione α-CHCA&quot; e &quot;soluzione DHB&quot; in rapporti diversi, quando si analizzano le proteine ​​con massa inferiore a 100 kDa. Per example un rapporto di 40:60 tra α-CHCA e DHB (vol / vol) produce una risoluzione migliore, ma meno sensibilità (vedi la discussione). 6. Deposizione del campione sul target MALDI <ol><li> Cassetta 0,5 microlitri del campione proteico sullo strato sottile α-CHCA precedentemente preparato. Subito dopo, aggiungere 0,5 ml di soluzione di matrice (cioè la soluzione SA oppure la soluzione α-CHCA o il &quot;mix CHCA_DHB&quot;). Ciò implica la miscelazione del campione e la matrice sul bersaglio. </li></ol> Nota: Di solito si mescola il campione di proteine ​​con la matrice in un rapporto di 1:1. Questo rapporto è fondamentale per la buona qualità degli spettri MALDI. Se volete testare diverse concentrazioni del campione, è possibile utilizzare la soluzione di acido ACN_formic (sopra descritto) per diluire il campione. Nota: Se si preferisce, è possibile mescolare il campione e la matrice in un tubo e poi depositare il misto &quot;sample_matrix soluzionezione &quot;a strato sottile. Nota: Si consiglia di testare diverse concentrazioni del campione perché diluendo il campione consente di ridurre l&#39;interferenza di contaminanti. Per diluire il campione, è possibile utilizzare la soluzione di acido ACN_formic (sopra descritto) per diluire il campione. 7. Calibratore Deposizione <ol><li> Cassetta di 0,5 ml di standard calibrante (ad esempio &quot;proteina normale II&quot;, Bruker Daltonics, Bremen) quindi aggiungere 0,5 ml di soluzione di matrice. </li></ol> Nota: Caricare il calibrante sulla piastra MALDI accanto ai punti di campionamento delle proteine ​​(vedi la discussione). 8. MALDI Spectra Acquisizione di Calibrant e proteine ​​Campioni Una volta che i campioni ed il calibrante vengono essiccati, si possono osservare le &quot;macchie&quot; sotto un microscopio. Questa osservazione è opzionale e può essere interessante soprattutto per i novizi. Per acquisire gli spettri campione, inserire the destinazione nello strumento MALDI-TOF e scegliendo i parametri strumentali appropriati che sono differenti per ciascun tipo di apparecchiatura. Per ottenere il più appropriato set-up si dovrebbe seguire le raccomandazioni del produttore. Come considerazioni generali quando si analizzano proteine ​​intatte, si dovrebbe usare lo strumento in modalità lineare (non in modalità riflettore, che è appropriato per i peptidi analisi). Normalmente utilizziamo il nostro strumento in modalità positiva di litio. Inoltre, un parametro chiave è il &quot;estrazione di ioni pulsata&quot;, che migliora la risoluzione strumentale 31. In termini semplici, il &quot;estrazione ione impulsiva&quot; può essere definito come una pausa tra la generazione di ioni del campione e il momento in cui gli ioni vengono accelerati verso il rivelatore. Quando si analizzano proteine ​​intatte, bisogna utilizzato un &quot;estrazione di ioni impulsi&quot; (es. 500 nanosecondi) maggiore di quando si osserva peptidi (ad esempio 80 nsec). Scegliere l&#39;appropriato intervallo m / z, acquisire gli spettri of la calibrante e calibrare lo strumento. Quando si acquista gli spettri dei vostri campioni, utilizzare l&#39;intensità del laser appropriato (vedi la discussione).

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Abbiamo presentato un protocollo dettaglio di acquisire spettri di massa di alta qualità di grandi proteine ​​intatte con pesi molecolari superiori a 100 kDa, utilizzando uno strumento MALDI-TOF. Un certo numero di aspetti critici concernenti la preparazione del campione deve essere attentamente valutata al fine di migliorare la qualità degli spettri di massa. Matrici e solventi di elevata purezza sono di importanza critica perché tutti i contaminanti presenti nelle matrici e solventi sono concentrati sul target MALDI dopo evaporazione del solvente. Al fine di migliorare la purezza delle matrici MALDI è possibile purificare utilizzando metodi classici ricristallizzazione (vedi sopra). Si consiglia inoltre di preparare appena le soluzioni matrici (almeno una volta alla settimana) per migliorare la cristallizzazione della matrice e per evitare la degradazione della matrice. L&#39;approccio deposizione di matrice è molto critica per la qualità finale degli spettri. Come descritto sopra, il metodo strato sottile è il nostro metodo of scelta 12. Inoltre, abbiamo ottimizzato l&#39;approccio per la deposizione del primo strato. Quando la matrice viene sciolto in acetone per ottenere una soluzione satura, il propanone permette veloce evaporazione del solvente, ma anche rende le dimensioni del primo strato molto difficile da controllare. Si consiglia di utilizzare una punta GELoader come poco pennello che si immergere nella soluzione matrix_acetone per ottenere un volume minimo che si deposita rapidamente sul bersaglio. La dimensione del primo strato in qualche modo controlla la dimensione finale dello spot MALDI: un piccolo punto (cioè 0.5-0.75 mm di diametro) è preferibile perché in questo caso la concentrazione del campione è superiore nel caso di una grande macchia. Ottenere un piccolo punto si differenzia da quello strato ultra-sottile precedentemente proposto in un video JOVE 15. In Fenyo et al. Soluzione strato sottile è diffuso in tutto il target MALDI utilizzando il lato di un puntale. Questo approccio richiede testare il sottile strato che dovrebbe soddisfare criteri specifici(Ad esempio la velocità di evaporazione del solvente). Se il criterio non è soddisfatto, il target MALDI deve essere lavato e un nuovo strato sottile deve essere preparato. Questo rende la preparazione abbastanza laboriosa per un novizio. Inoltre, la deposizione della miscela campione / matrice sulla piastra richiede l&#39;aspirazione del solvente in eccesso con una linea di vuoto e una fase di lavaggio con TFA 15 è necessario, rendendo il Fenyo et al. Preparazione un po &#39;più difficile che il nostro approccio. Il rapporto in volume tra la matrice ed il campione è molto importante per un&#39;analisi riuscita di proteine ​​intatte mediante MALDI-TOF. Dopo aver testato diversi rapporti si consiglia di utilizzare un rapporto di 1:1. Una matrice diversa: campione proporzione potrebbe compromettere la qualità degli spettri, probabilmente a causa di cristallizzazione disomogenea. L&#39;ordine in cui matrice e del campione vengono depositati è anche critico. Dopo aver depositato lo strato sottile matrice, il campione viene depositato e subito dopo (prima della SAMPLe Spot diventa secca) è aggiunto alla miscela CHCA_DHB. Questa procedura è stata definita come &quot;metodo sandwich&quot; 27, in cui solo il campione viene depositato tra due strati di matrice. In alternativa, la soluzione CHCA_DHB e il campione può essere miscelato in 0,5 ml di tubo e poi macchiato su strato sottile CHCA 12. Questo produce una macchia con uno strato omogeneo di cristalli risultanti in spettri di alta qualità. Nell&#39;analizzare proteine ​​con una massa inferiore a 100 kDa, la concentrazione di DHB può essere aumentata (es. 60:40 DHB: CHCA); questo può produrre più nitida picco, ma potrebbe compromettere la sensibilità di misurazione (ossia picchi meno intensi). Per una calibrazione dello strumento corretto, è essenziale depositare le norme calibrante molto vicino ai luoghi di esempio, permettendo di ottenere una migliore precisione di massa. A &quot;procedura di calibrazione pseudo-interno&quot; è stato precedentemente suggerito 15: dopo l&#39;acquisizione di uno spettro di esempio, il punto i calibrantes tiro laser e segnale del calibratore sono aggiunti allo spettro del campione. Ciò consente di calibrare internamente lo spettro del campione utilizzando i picchi calibrante. L&#39;energia laser dovrebbe essere anche attentamente controllata durante l&#39;acquisizione spettri. Nella maggior parte dei casi, maggiore energia aumenta la sensibilità, ma riduce la risoluzione. Si consiglia usando l&#39;energia minima possibile laser senza compromettere la sensibilità dell&#39;acquisizione. Inoltre, per migliorare la qualità spettrale, si può acquisire più tiri su ogni punto del campione. Normalmente i colpi più si acquisisce (1000-2000 colpi), maggiore è l&#39;intensità del segnale. Quando si colpisce il punto con il laser, si ha la necessità di trovare la giusta posizione (cioè &quot;sweet spot&quot;), dal momento che il campione non è omogeneamente distribuita. È possibile sparare sulla stessa area fino a quando il segnale è in aumento, e poi cercare di trovare un&#39;altra area contenente il campione. In conclusione, elevata purezza di matrici e solvgenitori, i metodi utilizzati per il campione e matrici deposizione sul bersaglio, la posizione degli standard utilizzati per la calibrazione, l&#39;intensità di energia laser, il tempo di acquisizione (numero di scatti / spot) sono fattori critici che si dovrebbe prendere in considerazione quando analizzando proteine ​​intatte da MALDI-TOF MS. Contributi Autore LS e EBE progettato gli esperimenti, condotti gli esperimenti di spettrometria di massa, hanno analizzato i dati, e ha scritto il manoscritto.

Biologia strutturale si basa sulla produzione di proteine ​​di alta qualità 1 e deve quindi essere accoppiato con tecniche efficienti ed affidabili per l&#39;analisi di proteine ​​2,3. Nel nostro spettrometria di massa (MS) laboratorio entro un istituto di biologia strutturale è necessario confermare sequenza primaria delle proteine, valutare la presenza di mutazioni e modificazioni post-traduzionali, la degradazione delle proteine, l&#39;omogeneità del campione, e la qualità di etichettatura isotopica (es deuterato proteine ​​per studi di risonanza magnetica nucleare 4). Dal momento che i biologi strutturali utilizzano proteolisi limitata per distinguere i domini strutturalmente rigidi da parti flessibili, abbiamo bisogno di caratterizzare in modo attendibile tali proteine ​​tronche con MS. Quando biomolecole sono analizzati da MS, due possibili approcci sono utilizzati per ionizzare dolcemente tali molecole pesanti e labili. Ionizzazione electrospray (ESI) ionizza le molecole direttamente dalfase liquida 5; matrix-assisted laser desorbimento di ionizzazione (MALDI) richiede che le biomolecole sono co-cristallizzati con molecole organiche-ultravioletti di assorbimento (cioè matrice molecole) 6. ESI tempo di volo (TOF) MS accoppiata alla cromatografia liquida è diventata una tecnica di routine per l&#39;analisi di proteine ​​intatte, perché permette la determinazione della massa con elevata precisione (≤ 50 ppm). Tuttavia, è molto sensibile alla composizione del tampone campione (in particolare sali e detergenti) e di contaminanti (cioè polimeri) che sono talvolta difficili da eliminare, causando la soppressione del segnale dell&#39;analita. MALDI-TOF MS rappresenta una valida alternativa alla ESI-MS, perché le sue prestazioni è meno influenzata da componenti tampone, detergenti e contaminanti, e permette proteina intatta la determinazione della massa con sufficiente precisione (≤ 500 ppm) per la convalida sequenza. Dopo Protein digestione, MALDI-TOF MS può essere utilizzata anche per analizzare i peptidi ottenuti per ulteriore conferma sequenza primaria dalla cosiddetta &quot;massa peptide fingerprinting&quot;. Nelle nostre mani, la determinazione della massa di proteine ​​intatte, che sono più grandi di 100 kDa ed eterogeneo (a causa di modifiche o troncamenti), è più facile da MALDI-MS che da ESI-MS. Ciò è dovuto alla mancanza di distribuzioni stato di carica sovrapposti presenti negli spettri ESI. Inoltre, poiché il processo MALDI non dipende dalle dimensioni analita 7, tali rendimenti metodo ad alta sensibilità quando una massa biomolecola è superiore a 100 kDa. Analisi notevoli di proteine ​​intatte sono state effettuate utilizzando strumenti fatti in casa tra la fine del 1980 e l&#39;inizio del 1990 8-11. MALDI-TOF può anche essere usato come strumento di screening per valutare la qualità di campioni proteici perché richiede meno tempo per la preparazione del campione ed è meno suscettibile di INTERFERENces dovute a impurità comuni (ad esempio sali). Dopo una prima, rapida valutazione tramite MALDI-MS, un campione può essere ulteriormente analizzato mediante ESI-TOF per determinare la sua massa con maggiore precisione. Inoltre, MALDI genera ioni contenenti meno spese rispetto ESI e quindi acquisizione e l&#39;interpretazione dei dati MALDI è più semplice. Questo permette agli studenti che lavorano nel campo della biologia strutturale per analizzare le proteine ​​ricombinanti subito dopo una breve formazione. Due fattori chiave influenzano la qualità degli spettri MALDI: la matrice e la tecnica utilizzata per la deposizione di matrice (gocciolina es essiccati 8 e sottile strato 12-16,17,18). Una matrice organica singolo [ad esempio acido sinapinic (SA) 19-21 o α-ciano-4-idrossicinnamici acido (α-CHCA) 14,22,23] è spesso usato per l&#39;esame MS di proteine ​​intatte e complessi proteici reticolato . Utilizzo di α-CHCA, gruppo Chait precedentemente presentato un protocollo dettagliato per la preparing uno strato ultra sottile prima dell&#39;analisi MALDI di proteine ​​solubili e di membrana 14,15. Recentemente, Gorka et al. Illustrato il rivestimento bersaglio a base di grafite per migliorare l&#39;analisi MALDI di peptidi e proteine ​​utilizzando α-CHCA come matrice 24. Qui, presentiamo un semplice protocollo per l&#39;analisi di proteine ​​intatte mediante MALDI-TOF MS, utilizzando una miscela di due matrici: acido 2,5-diidrossibenzoico (DHB) e α-CHCA 25. Sistematicamente valutato le prestazioni del mix DHB-CHCA rispetto alle matrici SA e α-CHCA, per il controllo di proteine ​​intatte. La miscela di matrice permette una migliore risoluzione (cioè i picchi di proteine ​​sono molto più nitida). Inoltre, la presenza di intense multipli ioni spese (cioè M +2 H 2 +, M +3 H 3 +, ecc) consente una più precisa determinazione della massa perché la risoluzione degli strumenti MALDI-TOF assiale è maggiore a massa inferiore sopra la carica (m / z) 26. Ciò è particolarmente utile per la determinazione del peso molecolare delle proteine ​​più grandi di 100 kDa. Maggiore sensibilità viene raggiunta anche mediante la miscela DHB-CHCA (0,5 pmoli di proteine ​​macchiati sul target MALDI). Come abbiamo accennato in precedenza, un fattore importante che deve essere considerato quando si utilizzano strumenti MALDI è la deposizione di matrice. Laugesen et al. Proposto l&#39;uso della miscela DHB-CHCA per la prima volta 25, utilizzando la deposizione gocciolina essiccata. Tuttavia, abbiamo osservato risultati migliori (ad es sensibilità molto più alto) quando abbiamo utilizzato il metodo sottile strato in cui il primo strato è formato da α-CHCA disciolto in acetone. Il sottile strato metodo 12,27 implica la formazione di un substrato omogeneo di cristalli matrice sul target MALDI, che è stato descritto in un video Giove precedenza 15. Poi, il campione viene depositato su questo substrato, e infinematrice aggiuntiva viene depositata (vedi sotto). In questo articolo, abbiamo anche illustrare come per depositare il campione sul bersaglio MALDI, ma anche come pulire l&#39;obiettivo del 15 per ricristallizzare, e prepariamo le matrici. Per concludere ci proponiamo di fornire tutte le informazioni necessarie per l&#39;analisi di proteine ​​intatte agli scienziati (in particolare, i biologi strutturali) che hanno bisogno di valutare la qualità delle proteine ​​prodotte in maniera rapida e semplice e che non hanno molta familiarità con MALDI-TOF MS. Come previsto a metà del 1990 28, MS ha avuto un maggiore impatto sulla ricerca biologica, come la sua accessibilità ai biologi è aumentato. Ci auguriamo che le informazioni che abbiamo fornito saranno utili per rendere MALDI-TOF accessibili ai biologi e scienziati che vorrebbero iniziare a utilizzare la spettrometria di massa.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3253</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizima</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6066</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Bio-Spin 6 chromatography columns</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>732-6221</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaspin 500</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS0122</td>
			<td>various molecular weight cut off</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>14262</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>02860</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIMTECH SCIENCE Precision Wipes Tissue Wipers</td>
			<td>Kimberly Clark</td>
			<td>05511</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&alpha;-cyano-4-hydroxycinnamic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C8982</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>650501</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,5-dihydroxybenzoic acid</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>39319</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GELoader Tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 001.222</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34998</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>09676</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>302031</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Standard II</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td>207234</td>
			<td>It contains Trypsinogen, Protein A, Serum Albumin-Bovine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunoglobulin G</td>
			<td>ABSciex</td>
			<td>GEN602151</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water purifier PURELAB Ultra Analytic</td>
			<td>ELGA LabWater</td>
			<td>89204-052</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoflex MALDI-TOF instrument</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALDI-TOF target</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight (maldi-tof) mass spectrometric analysis of intact proteins larger than 100 kda

Determinare efficacemente masse di proteine ​​è fondamentale per molti studi biologici (ad esempio per le indagini di biologia strutturale). Accurata determinazione della massa permette di valutare la correttezza della sequenza primaria della proteina, la presenza di mutazioni e / o modificazioni post-traduzionali, la possibile degradazione delle proteine, l&#39;omogeneità del campione, e il grado di isotopo incorporazione in caso di etichettatura (ad esempio 13 C etichettatura ). Ionizzazione elettrospray (ESI) spettrometria di massa (MS) è ampiamente usato per la determinazione della massa di proteine ​​denaturate, ma la sua efficienza è influenzato dalla composizione del tampone campione. In particolare, la presenza di sali, detergenti e contaminanti compromette fortemente l&#39;efficacia di analisi delle proteine ​​da ESI-MS. Matrix-assisted laser desorbimento / ionizzazione (MALDI) MS è un&#39;alternativa interessante, grazie alla sua tolleranza al sale e la semplicità di acquisizione dati e interpretazionezione. Inoltre, la determinazione della massa di grandi proteine ​​eterogenee (più grande di 100 kDa) è più facile da MALDI-MS per l&#39;assenza di sovrapposizione distribuzioni alta carica dello stato che sono presenti negli spettri ESI. Presentiamo qui un approccio accessibile per analizzare le proteine ​​più grandi di 100 kDa mediante MALDI-tempo di volo (TOF). Illustriamo i vantaggi di usare una miscela di due matrici (cioè acido 2,5-diidrossibenzoico e acido α-ciano-4-idrossicinnamico) e l&#39;utilità del metodo strato sottile come approccio per la deposizione del campione. Discutiamo anche il ruolo critico della matrice e la purezza del solvente, degli standard utilizzati per la calibrazione, l&#39;energia laser, e del tempo di acquisizione. Nel complesso, forniamo le informazioni necessarie per un novizio per l&#39;analisi di proteine ​​intatte più grandi di 100 kDa di MALDI-MS.

Abbiamo analizzato una proteina intatta (regione cromosomica manutenzione 1 proteina, CRM1; peso molecolare: 123.386 Da) utilizzando due matrici diverse, due metodi di deposizione, e la stessa intensità del laser (Figura 1). SA ed una miscela CHCA_DHB stati utilizzati come matrici. La miscela di prodotto spettri di massa di elevata qualità in termini di rapporto segnale rumore e di sensibilità (Figure 1A e B). In particolare, abbiamo rilevato 0,5 pmoli di proteine ​​depositate sul bersaglio MALDI (Figura 1C). La stessa quantità di proteina era appena rilevabile utilizzando SA (Figura 1D). Inoltre, mediante la miscela matrici, il metodo di scelta per la deposizione di matrice è stato l&#39;approccio &quot;strato sottile&quot; (Figura 1A). Utilizzando il metodo &quot;secco gocciolina&quot;, non abbiamo rilevato alcuna proteina con una massa superiore a 100 kDa (dati non mostrati). Utilizzando la miscela CHCA_DHB (Figure 1A e 1C), moltiplicare carica ionica del Protein sono stati osservati, permettendo la determinazione della massa con maggiore precisione perché la risoluzione picco in strumenti MALDI-TOF assiali è inversamente proporzionale alla m / z 26. Abbiamo anche analizzato monomerica beta-galattosidasi (116.300 Da) (Figura 2). Gli spettri CHCA_DHB erano meglio gli spettri SA in termini di sensibilità e risoluzione. Inoltre, la presenza di ioni moltiplicano cariche (M 2 +, M 3 + e 4 + M) ha permesso di confermare la massa della proteina con maggiore precisione (Figure 2A e 2C). Utilizzando l&#39;approccio strato sottile, abbiamo confrontato le prestazioni della miscela CHCA_DHB, SA e solo α-CHCA per l&#39;analisi di una immunoglobulina, IgG (148500 Da) (Figura 3). Quando mettiamo in relazione i diversi dati, segnali di proteine ​​erano più alti e con una migliore risoluzione spettri CHCA_DHB. Per concludere, l&#39;uso della miscela CHCA_DHB e il metodo di deposizione strato sottile<html> dimostrato miglioramenti significativi nella qualità di grande intatta spettri di massa proteica acquisito utilizzando uno strumento MALDI TOF. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50635/50635fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50635/50635fig1.jpg" /> Figura 1. Analisi MALDI-TOF della regione cromosomica intatta manutenzione 1 proteina, (CRM1), peso molecolare: 123.386 Da. A) 1 pmole di CRM1 è stato analizzato utilizzando il mix DHB_CHCA come matrice B) quantità: 1. Pmole; matrice:. SA C) importo: 0,5 pmole; matrice:. DHB_CHCA D) importo: 0,5 pmole; matrice: SA. Il segnale dei picchi, espressa in una scala in unità arbitrarie di intensità, è normalizzato al valore massimo presente in ogni spettro. pg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/50635/50635fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. Analisi MALDI-TOF intatta beta-galattosidasi (116.300 Da). A) Importo: 20 pmoli; DHB_CHCA matrice B) Importo:. Pmoli 20; matrice:. SA C) importo: 5 pmoli; matrice:. DHB_CHCA D) quantità: 5 pmoli; matrice: SA. <img alt="Figura 3" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50635/50635fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50635/50635fig3.jpg" /> Figura 3. Analisi MALDI-TOF di immunoglobuline intatte, IgG (148.500 Da), importo:. 1.7 pmoli Gli spettri ottenuti con la miscela CHCA_DHB erano molto più intense (massima: 8200 unità arbitraria, au) che l&#39;spettri SA (massimo: 1.200 au) e spettri α-CHCA (massimo: 4500 au)

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Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight MALDI-TOF Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins Larger than 100 kDa

Misura della massa accurata rappresenta un passo importante nel corso dell&#39;inchiesta di proteine. Matrix-assisted laser desorbimento / ionizzazione (MALDI) spettrometria di massa (MS) può essere utilizzato per tale determinazione e il suo vantaggio chiave è la tolleranza di sali, detergenti e contaminanti. Qui illustriamo un approccio accessibili per l&#39;analisi di proteine ​​più grandi di 100 kDa tramite MALDI-MS.

Matrix-assisted laser di desorbimento / ionizzazione Time of Flight (MALDI-TOF) Massa spettrometrica Analisi delle proteine ​​intatte grande di 100 kDa

Effectively determining masses of proteins is critical to many biological studies (e.g. for structural biology investigations). Accurate mass ...

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Research

JoVE Journal

Chemistry

Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight (MALDI-TOF) Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins Larger than 100 kDa

80.3K Views.  Université J. Fourier.  Misura della massa accurata rappresenta un passo importante nel corso dell'inchiesta di proteine. Matrix-assisted laser desorbimento / ionizzazione (MALDI) spettrometria di massa (MS) può essere utilizzato per tale determinazione e il suo vantaggio chiave è la tolleranza di sali, detergenti e contaminanti. Qui illustriamo un approccio accessibili per l'analisi di proteine ​​più grandi di 100 kDa tramite MALDI-MS. 

Video: Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight MALDI-TOF Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins Larger than 100 kDa

Profiling the Triacylglyceride Contents in Bat Integumentary Lipids by Preparative Thin Layer Chromatography and MALDI-TOF Mass Spectrometry

The mammalian integument includes sebaceous glands that secrete an oily material onto the skin surface. Sebum production is part of the innate immune system that is protective against pathogenic microbes. Abnormal sebum production and chemical composition are also a clinical symptom of specific skin diseases. Sebum contains a complex mixture of lipids, including triacylglycerides, which is species-specific. The broad chemical properties exhibited by diverse lipid classes hinder the specific determination of sebum composition. Analytical techniques for lipids typically require chemical derivatizations that are labor-intensive and increase sample preparation costs. This paper describes how to extract lipids from mammalian integument, separate broad lipid classes by thin-layer chromatography, and profile the triacylglyceride contents using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. This robust method enables a direct determination of the triacylglyceride profiles among species and individuals, and it can be readily applied to any taxonomic group of mammals.

Mammalian integument contains solvent-extractable lipids that can provide chemical compositions characteristic of individual species. This paper presents a routine method for separating broad lipid classes isolated from integumentary tissues using thin layer chromatography and determining the triacylglyceride profile by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry.

Profiling Contenuti Triacylglyceride nella BAT tegumentario lipidi da preparativa cromatografia su strato sottile e MALDI-TOF

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Chimica

Mass Spectrometric Approaches to Study Protein Structure and Interactions in Lyophilized Powders

Amide hydrogen/deuterium exchange (ssHDX-MS) and side-chain photolytic labeling (ssPL-MS) followed by mass spectrometric analysis can be valuable for characterizing lyophilized formulations of protein therapeutics. Labeling followed by suitable proteolytic digestion allows the protein structure and interactions to be mapped with peptide-level resolution. Since the protein structural elements are stabilized by a network of chemical bonds from the main-chains and side-chains of amino acids, specific labeling of atoms in the amino acid residues provides insight into the structure and conformation of the protein. In contrast to routine methods used to study proteins in lyophilized solids (e.g., FTIR), ssHDX-MS and ssPL-MS provide quantitative and site-specific information. The extent of deuterium incorporation and kinetic parameters can be related to rapidly and slowly exchanging amide pools (Nfast, Nslow) and directly reflects the degree of protein folding and structure in lyophilized formulations. Stable photolytic labeling does not undergo back-exchange, an advantage over ssHDX-MS. Here, we provide detailed protocols for both ssHDX-MS and ssPL-MS, using myoglobin (Mb) as a model protein in lyophilized formulations containing either trehalose or sorbitol.

Here, we present detailed protocols for solid-state amide hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry (ssHDX-MS) and solid-state photolytic labeling mass spectrometry (ssPL-MS) for proteins in solid powders. The methods provide high-resolution information on protein conformation and interactions in the amorphous solid-state, which may be useful in formulation design.

Mass spettrometrica Approcci alla struttura studio e interazioni proteina in liofilizzati Polveri

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A method for species identification of botanical material by direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry and multivariate statistical analysis is presented.

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Analisi dell'espirato in tempo reale tramite ionizzazione secondaria Nanoelectrospray accoppiata alla spettrometria di massa ad alta risoluzione

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Characterization of Synthetic Polymers via Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight (MALDI-TOF) Mass Spectrometry

There are many techniques that can be employed in the characterization of synthetic homopolymers, but few provide as useful of information for end group analysis as matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS). This tutorial demonstrates methods for optimization of the sample preparation, spectral acquisition, and data analysis of synthetic polymers using MALDI-TOF MS. Critical parameters during sample preparation include the selection of the matrix, identification of an appropriate cationization salt, and tuning the relative proportions of the matrix, cation, and analyte. The acquisition parameters, such as mode (linear or reflector), polarization (positive or negative), acceleration voltage, and delay time, are also important. Given some knowledge of the chemistry involved to synthesize the polymer and optimizing both the data acquisition parameters and the sample preparation conditions, spectra should be obtained with sufficient resolution and mass accuracy to enable the unambiguous determination of the end groups of most homopolymers (masses below 10,000) in addition to the repeat unit mass and the overall molecular weight distribution. Though demonstrated on a limited set of polymers, these general techniques are applicable to a much wider range of synthetic polymers for determining mass distributions, though end group determination is only possible for homopolymers with narrow dispersity.

Characterization of Synthetic Polymers via Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight MALDI-TOF Mass Spectrometry

A protocol for the matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) characterization of synthetic polymers is described including the optimization of sample preparation, spectral acquisition, and data analysis.

Caratterizzazione di polimeri sintetici tramite matrice assistita Laser desorbimento ionizzazione tempo di spettrometria di massa (MALDI-TOF) di volo

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An Efficient Sample Preparation Method to Enhance Carbohydrate Ion Signals in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry

Sample preparation is a critical process in mass spectrometry (MS) analysis of carbohydrates. Although matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) MS is the method of choice in carbohydrate analysis, poor ion signal and data reproducibility of carbohydrate samples continue to be severe problems. For quantitative analysis of carbohydrates, an effective analytical protocol providing superior data quality is necessary. This video demonstrates sample preparation protocols to improve signal intensity and minimize data variation of carbohydrates in MALDI-MS. After drying and crystallization of sample droplets, the crystal morphology is reformed by methanol before mass spectrometric analysis. The enhancement in carbohydrate signal is examined with MALDI imaging mass spectrometry (IMS). Experimental results show that crystal reformation adjusts crystalline structures and redistributes carbohydrate analytes. In comparison with the dried droplet preparation method in conventional MALDI-MS, reforming carbohydrate crystal morphologies with methanol shows significantly better signal intensity, ion image distribution, and data stability. Since the protocols demonstrated herein do not involve changes in sample composition, they are generally applicable to various carbohydrates and matrixes.

A protocol for enhancing carbohydrate ion signals in MALDI mass spectrometry by reforming crystalline structures during sample preparation processes is demonstrated.

Un metodo di preparazione efficiente dei campioni per migliorare i segnali dello ione del carboidrato in spettrometria di massa di Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization

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Imaging Corrosion at the Metal-Paint Interface Using Time-of-Flight Secondary Ion Mass Spectrometry

Corrosion developed at the paint and aluminum (Al) metal-paint interface of an aluminum alloy is analyzed using time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS), illustrating that SIMS is a suitable technique to study the chemical distribution at a metal-paint interface. The painted Al alloy coupons are immersed in a salt solution or exposed to air only. SIMS provides chemical mapping and 2D molecular imaging of the interface, allowing direct visualization of the morphology of the corrosion products formed at the metal-paint interface and mapping of the chemical after corrosion occurs. The experimental procedure of this method is presented to provide technical details to facilitate similar research and highlight pitfalls that may be encountered during such experiments.

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Corrosione dell'imaging nell'interfaccia Metal-Paint con spettrometria di massa ionica secondaria a tempo di volo

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Analysis of Complex Molecules and Their Reactions on Surfaces by Means of Cluster-Induced Desorption/Ionization Mass Spectrometry

Desorption/Ionization Induced by Neutral SO2 Clusters (DINeC) is employed as a very soft and efficient desorption/ionization technique for mass spectrometry (MS) of complex molecules and their reactions on surfaces. DINeC is based on a beam of SO2 clusters impacting on the sample surface at low cluster energy. During cluster-surface impact, some of the surface molecules are desorbed and ionized via dissolvation in the impacting cluster; as a result of this dissolvation-mediated desorption mechanism, low cluster energy is sufficient and the desorption process is extremely soft. Both surface adsorbates and molecules of which the surface is composed of can be analyzed. Clear and fragmentation-free spectra from complex molecules such as peptides and proteins are obtained. DINeC does not require any special sample preparation, in particular no matrix has to be applied. The method yields quantitative information on the composition of the samples; molecules at a surface coverage as low as 0.1 % of a monolayer can be detected. Surface reactions such as H/D exchange or thermal decomposition can be observed in real-time and the kinetics of the reactions can be deduced. Using a pulsed nozzle for cluster beam generation, DINeC can be efficiently combined with ion trap mass spectrometry. The matrix-free and soft nature of the DINeC process in combination with the MSn capabilities of the ion trap allows for very detailed and unambiguous analysis of the chemical composition of complex organic samples and organic adsorbates on surfaces.

Neutral SO2 clusters of low kinetic energy (&#60; 0.8 eV/constituent) are used to desorb complex surface molecules such as peptides or lipids for further analysis by means of mass spectrometry using an ion trap mass spectrometer. No special sample preparation is required, and real-time observation of reactions is possible.

Analisi delle molecole complesse e delle loro reazioni sulle superfici mediante mezzi di desorpazione/spettrometria di massa indotta da cluster

Desorption/Ionization Induced by Neutral SO2 Clusters (DINeC) is employed as a very soft and efficient desorption/ionization technique for mass ...

Identification of Antibacterial Immunity Proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down Proteomic Analysis

This protocol identifies the immunity proteins of the bactericidal enzymes: colicin E3 and bacteriocin, produced by a pathogenic Escherichia coli strain using antibiotic induction, and identified by MALDI-TOF-TOF tandem mass spectrometry and top-down proteomic analysis with software developed in-house. The immunity protein of colicin E3 (Im3) and the immunity protein of bacteriocin (Im-Bac) were identified from prominent b- and/or y-type fragment ions generated by the polypeptide backbone cleavage (PBC) on the C-terminal side of aspartic acid, glutamic acid, and asparagine residues by the aspartic acid effect fragmentation mechanism. The software rapidly scans in silico protein sequences derived from the whole genome sequencing of the bacterial strain. The software also iteratively removes amino acid residues of a protein sequence in the event that the mature protein sequence is truncated. A single protein sequence possessed mass and fragment ions consistent with those detected for each immunity protein. The candidate sequence was then manually inspected to confirm that all detected fragment ions could be assigned. The N-terminal methionine of Im3 was post-translationally removed, whereas Im-Bac had the complete sequence. In addition, we found that only two or three non-complementary fragment ions formed by PBC are necessary to identify the correct protein sequence. Finally, a promoter (SOS box) was identified upstream of the antibacterial and immunity genes in a plasmid genome of the bacterial strain.

Identification of Antibacterial Immunity Proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down Proteomic Analysis

Here we present a protocol for the rapid identification of proteins produced by genomically sequenced pathogenic bacteria using MALDI-TOF-TOF tandem mass spectrometry and top-down proteomic analysis with software developed in-house. Metastable protein ions fragment because of the aspartic acid effect and this specificity is exploited for protein identification.

Identificazione di proteine immunitarie antibatteriche in Escherichia coli utilizzando MALDI-TOF-TOF-MS/MS e analisi proteomica top-down

This protocol identifies the immunity proteins of the bactericidal enzymes: colicin E3 and bacteriocin, produced by a pathogenic Escherichia coli strain ...

Capillary Electrophoresis-based Hydrogen/Deuterium Exchange for Conformational Characterization of Proteins with Top-down Mass Spectrometry

Resolving conformational heterogeneity of multiple protein states that coexist in solution remains one of the main obstacles in the characterization of protein therapeutics and the determination of the conformational transition pathways critical for biological functions, ranging from molecular recognition to enzymatic catalysis. Hydrogen/deuterium exchange (HDX) reaction coupled with top-down mass spectrometric (MS) analysis provides a means to characterize protein higher-order structures and dynamics in a conformer-specific manner. The conformational resolving power of this technique is highly dependent on the efficiencies of separating protein states at the intact protein level and minimizing the residual non-deuterated protic content during the HDX reactions. 
Here we describe a capillary electrophoresis (CE)-based variant of the HDX MS approach that aims to improve the conformational resolution. In this approach, proteins undergo HDX reactions while migrating through a deuterated background electrolyte solution (BGE) during the capillary electrophoretic separation. Different protein states or proteoforms that coexist in solution can be efficiently separated based on their differing charge-to-size ratios. The difference in electrophoretic mobility between proteins and protic solvent molecules minimizes the residual non-deuterated solvent, resulting in a nearly complete deuterating environment during the HDX process. The flow-through microvial CE-MS interface allows efficient electrospray ionization of the eluted protein species following a rapid mixing with the quenching and denaturing modifier solution at the outlet of the sprayer. The online top-down MS analysis measures the global deuteration level of the eluted intact protein species, and subsequently, the deuteration of their gas-phase fragments. This paper demonstrates this approach in differential HDX for systems, including the natural protein variants coexisting in milk.

Presented here is a protocol for a capillary electrophoresis-based hydrogen/deuterium exchange (HDX) approach coupled with top-down mass spectrometry. This approach characterizes the difference in higher-order structures between different protein species, including proteins in different states and different proteoforms, by conducting concurrent differential HDX and electrophoretic separation.

Scambio idrogeno/deuterio basato sull'elettroforesi capillare per la caratterizzazione conformazionale di proteine con spettrometria di massa top-down

Resolving conformational heterogeneity of multiple protein states that coexist in solution remains one of the main obstacles in the characterization of ...

Matrix-assisted laser di desorbimento / ionizzazione Time of Flight (MALDI-TOF) Massa spettrometrica Analisi delle proteine intatte grande di 100 kDa

PLAYLIST

Matrix-assisted laser di desorbimento / ionizzazione Time of Flight (MALDI-TOF) Massa spettrometrica Analisi delle proteine ​​intatte grande di 100 kDa

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Matrix-assisted laser di desorbimento / ionizzazione Time of Flight (MALDI-TOF) Massa spettrometrica Analisi delle proteine intatte grande di 100 kDa